林秀仙 罗爱勤 陈亮
[摘要] 意图 比较桑叶总黄酮不同的纯化工艺，为找到一种总黄酮含量>15%，简洁可行，廉价且适于出产的纯化工艺。 办法 选用D101型、AB-8型和JD-1型大孔吸附树脂吸附法，乙酸乙酯萃取法，醇提水沉法，醇提-水沉-醇沉法6种办法对桑叶总黄酮进行纯化，以总黄酮的收率和含量为调查目标进行点评。 成果 6种办法制备的总黄酮的百分含量依次为：50.3%、48.5%、55.7%、82.1%、10.8%、18.5%，产品收率依次为：2.37%、2.42%、2.28%、0.45%、18.21%、15.93%。 定论 选用醇提-水沉-醇沉法即可得到契合要求的桑叶总黄酮。
[关键词] 桑叶；总黄酮；纯化工艺
[中图分类号] R284 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）02（a）-0010-03
桑叶为桑科植物桑（Morus alba L.）的枯燥叶，味甘、苦，性寒，归肺、肝经；具有分散风热，清肺润燥，清肝明意图成效；用于风热伤风，肺热燥咳，头昏头痛，目赤昏花等症[1]。桑叶的生物活性物质主要有黄酮类化合物、生物碱、多糖、桑叶蛋白等[2]，其间黄酮类化合物含有桑色素、芸香苷、槲皮素、异槲皮素、紫云英苷等，含量占干叶重的1.0%～3.0%，是植物中茎叶黄酮类化合物含量较高的一种[3]。黄酮类化合物作为桑叶的重要活性成分之一，具有抗氧化、降血压、降血脂、降血糖、避免动脉硬化和抗衰老等成效[4]。桑叶中总黄酮类化合物的常用提取办法是：以浓度约为70%的乙醇为提取溶剂，用浸渍法、超声波法或加热回流法等进行提取[3-7]。本实验以70%乙醇为溶剂，加热回流提取桑叶后，别离调查了不同的纯化工艺，并以总黄酮为调查目标，制备含量达15%以上的桑叶总黄酮，为桑叶总黄酮的进一步开发供给参阅。
1 资料与仪器
1.1 资料
桑叶（广东广弘药材有限公司，20130701），芦丁对照品（我国药品生物制品检定所，100080-200707），D101型大孔树脂、AB-8型大孔树脂、JD-1型大孔树脂（净品型，天津农药股份有限公司树脂分公司），95%乙醇（医用级），水为蒸馏水，其他试剂均为剖析纯。
1.2 仪器
R-201旋转蒸腾仪（上海申科机械研讨所），YZG-1000A型真空枯燥机（常州市范群枯燥设备有限公司），BS210S型电子天平（德国赛多利斯），UV-2550型紫外分光光度计（日本岛津公司），层析柱（直径2.5 cm×50 cm）。
2 办法与成果
2.1 桑叶总黄酮的纯化办法
2.1.1 桑叶总黄酮的提取 称取桑叶1 kg，参加10倍量70%乙醇，加热回流提取2次，1.5 h/次，滤过，兼并滤液，滤液减压浓缩至无乙醇气味，加水稀释至10 L，备用。
2.1.2 D101型树脂吸附法 称取已处理好的D101型树脂50 g，用湿法装柱法装入层析柱（直径2.5 cm×50 cm）中。将“2.1.1”中稀释的水溶液500 ml，参加树脂柱内，操控流速为2～4 ml/min。当溶液悉数吸附后，用蒸馏水（3 ml/min）洗脱至流出液无色。再用70%乙醇400 ml洗脱，洗脱速度3～5 ml/min，搜集乙醇洗脱液，减压浓缩、枯燥，枯燥物称重，并用紫外分光光度法测固体物中的总黄酮含量[8-10]。
2.1.3 AB-8型树脂吸附法 称取已处理好的AB-8型树脂50 g，用湿法装柱法装入层析柱（直径2.5 cm×50 cm）中。将“2.1.1”中稀释的水溶液500 ml，参加树脂柱内，操控流速为2～4 ml/min。当溶液悉数吸附后，用蒸馏水（3 ml/min）洗脱至流出液无色。再用70%乙醇400 ml洗脱，洗脱速度3～5 ml/min，搜集乙醇洗脱液，减压浓缩、枯燥，枯燥物称重，并用紫外分光光度法测固体物中的总黄酮含量。
2.1.4 JD-1型树脂吸附法 称取已处理好的JD-1型树脂50 g，用湿法装柱法装入层析柱（直径2.5 cm×50 cm）中。将“2.1.1”中稀释的水溶液500 ml，参加树脂柱内，操控流速为2～4 ml/min。当溶液悉数吸附后，用蒸馏水（3 ml/min）洗脱至流出液无色。再用70%乙醇400 ml洗脱，洗脱速度3～5 ml/min，搜集乙醇洗脱液，减压浓缩、枯燥，枯燥物称重，并用紫外分光光度法测固体物中的总黄酮含量。
2.1.5 乙酸乙酯萃取法 取“2.1.1”中稀释的水溶液500 ml，减压浓缩成100 ml，置250 ml分液漏斗中，用乙酸乙酯振摇提取3次，每次用100 ml。兼并3次萃取的乙酸乙酯，减压浓缩，转至蒸腾皿中，在水浴大将乙酸乙酯挥干，然后真空枯燥，得干膏，称重，并用紫外分光光度法测总黄酮的含量。
2.1.6 醇提水沉法 取“2.1.1”中稀释的水溶液500 ml，于4℃冰箱中放置12 h后，取出，滤过，取滤液减压浓缩，真空枯燥，得干膏，称重，并用紫外分光光度法测总黄酮的含量。
2.1.7 醇提-水沉-醇沉法 取“2.1.1”中稀释的水溶液500 ml，于4℃冰箱中放置12 h后，取出，滤过，取滤液减压浓缩至25 ml，加乙醇使含醇量达70%，拌和1 min，再于4℃冰箱中放置12 h后，取出，滤过，取滤液减压浓缩，真空枯燥，得干膏，称重，并用紫外分光光度法测总黄酮的含量。
2.2 总黄酮含量测定
2.2.1 对照品溶液的制备 精细称取芦丁对照品6.33 mg，加乙醇制成每毫升含芦丁0.2532 mg的溶液，即得。
2.2.2 规范曲线的制备 精细量取对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml，别离置25 ml量瓶中，各加水至6 ml，加5%亚硝酸钠溶液1 ml，使混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 ml，摇匀，放置6 min。加氢氧化钠试液10 ml，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应的试剂为空白，使用紫外-可见分光光度法，500 nm波长测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，制作规范曲线[1]。
成果表明，芦丁对照品在质量为0.1266～1.5192 mg范围内呈杰出的线性关系（表1），得回归方程为Y=0.3943X+0.0195，r=0.9999。
表1 芦丁规范曲线的制作
2.2.3 样品含量测定成果 称取各工艺制备的桑叶总黄酮1.0 g，置25 ml容量瓶中，加稀乙醇适量，超声处理30 min，冷却后加稀乙醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精细量取供试品溶液2 ml，置25 ml量瓶中，照规范曲线的制备项下的办法，自“加水至6 ml”起，依法测定吸光度，一起精细量取供试品溶液2 ml，置25 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为空白溶液。从规范曲线上读出供试品溶液中芦丁的量，核算，即得（表2）。
表2 不同纯化工艺制备的总黄酮收率和含量测定成果
2.2.4 准确度实验 选用加样收回法，取醇提-水沉-醇沉法所得样品（含总黄酮18.5%），称量6份，每份0.5 g，精细称定，别离精细参加芦丁对照品溶液（0.092 89 g/ml）1 ml，别离按“2.2.3”办法操作，测定每份总黄酮含量（表3）。成果表明，收回率均在95%～105%内，RSD=2.34%（<3%），契合办法学要求。
表3 准确度实验的成果
3 评论
从不同纯化工艺制备的桑叶总黄酮含量的测定成果剖析，乙酸乙酯萃取法的纯化作用较好，总黄酮含量最高，可是收率太低，阐明大部分黄酮类化合物没被保存下来，这样的工艺和成果在实践出产上不可取；大孔树脂吸附法的总黄酮含量也较高，尤其是D101型和JD-1型大孔树脂，可以使总黄酮含量达50%以上，可是收率较低，且出产工艺杂乱，操作繁琐，不契合工艺简洁廉价的要求；醇提-水沉-醇沉法，总黄酮含量契合15%以上的要求，收率高，工艺廉价简洁，因而更适于实践出产。
此外，本实验还为出产上制备各种含量的桑叶总黄酮供给了一个参阅，依据总黄酮的含量需求可选择相应的纯化工艺。
[参阅文献]
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：我国医药科技出版社，2010：279，372-373.
[2] 张艳艳，蒲秋燕，黄平，等.秦巴山区桑叶中芦丁提取工艺优化[J].安徽农业科学，2011，39（22）：13372-13373.
[3] 薛淑萍，张立伟.桑叶中总黄酮类化合物的提取工艺的优化[J].我国生化药物杂志，2010，31（6）：405.
[4] 贺伟强，向天勇，陶昆，等.呼应面法优化超声辅佐提取桑叶总黄酮的工艺研讨[J].我国农学通报，2012，28（33）：296-301.
[5] 励建荣，韩晓祥.超高压提取桑叶芦丁[J].剖析化学研讨简报，2008，36（3）：365-368.
[6] 兰才.桑叶总黄酮提取工艺的优选研讨[J].安徽农业科学，2013，41（3）：1260，1280.
[7] 章华伟，陈星宇，凌春英.呼应曲面优化醇法提取桑叶黄酮工艺研讨[J].氨基酸和生物资源，2010，34（3）：76-79.
[8] 薛淑萍，张立伟.正交实验法纯化桑叶中黄酮类化合物研讨[J].山西师范大学学报，2011，25（2）：93-94.
[9] 朱欣婷.大孔树脂纯化桑叶总黄酮的工艺条件研讨[J].安徽农业科学，2008，36（26）：11397-11398，11405.
[10] 陈菁菁，李向荣，方晓.大孔吸附树脂别离纯化桑叶总黄酮及其动力学研讨[J].浙江大学学报（医学版），2006， 35（2）：219-223.
（收稿日期：2013-11-13 本文修改：郭静娟）
成果表明，芦丁对照品在质量为0.1266～1.5192 mg范围内呈杰出的线性关系（表1），得回归方程为Y=0.3943X+0.0195，r=0.9999。
表1 芦丁规范曲线的制作
2.2.3 样品含量测定成果 称取各工艺制备的桑叶总黄酮1.0 g，置25 ml容量瓶中，加稀乙醇适量，超声处理30 min，冷却后加稀乙醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精细量取供试品溶液2 ml，置25 ml量瓶中，照规范曲线的制备项下的办法，自“加水至6 ml”起，依法测定吸光度，一起精细量取供试品溶液2 ml，置25 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为空白溶液。从规范曲线上读出供试品溶液中芦丁的量，核算，即得（表2）。
表2 不同纯化工艺制备的总黄酮收率和含量测定成果
2.2.4 准确度实验 选用加样收回法，取醇提-水沉-醇沉法所得样品（含总黄酮18.5%），称量6份，每份0.5 g，精细称定，别离精细参加芦丁对照品溶液（0.092 89 g/ml）1 ml，别离按“2.2.3”办法操作，测定每份总黄酮含量（表3）。成果表明，收回率均在95%～105%内，RSD=2.34%（<3%），契合办法学要求。
表3 准确度实验的成果
3 评论
从不同纯化工艺制备的桑叶总黄酮含量的测定成果剖析，乙酸乙酯萃取法的纯化作用较好，总黄酮含量最高，可是收率太低，阐明大部分黄酮类化合物没被保存下来，这样的工艺和成果在实践出产上不可取；大孔树脂吸附法的总黄酮含量也较高，尤其是D101型和JD-1型大孔树脂，可以使总黄酮含量达50%以上，可是收率较低，且出产工艺杂乱，操作繁琐，不契合工艺简洁廉价的要求；醇提-水沉-醇沉法，总黄酮含量契合15%以上的要求，收率高，工艺廉价简洁，因而更适于实践出产。
此外，本实验还为出产上制备各种含量的桑叶总黄酮供给了一个参阅，依据总黄酮的含量需求可选择相应的纯化工艺。
[参阅文献]
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：我国医药科技出版社，2010：279，372-373.
[2] 张艳艳，蒲秋燕，黄平，等.秦巴山区桑叶中芦丁提取工艺优化[J].安徽农业科学，2011，39（22）：13372-13373.
[3] 薛淑萍，张立伟.桑叶中总黄酮类化合物的提取工艺的优化[J].我国生化药物杂志，2010，31（6）：405.
[4] 贺伟强，向天勇，陶昆，等.呼应面法优化超声辅佐提取桑叶总黄酮的工艺研讨[J].我国农学通报，2012，28（33）：296-301.
[5] 励建荣，韩晓祥.超高压提取桑叶芦丁[J].剖析化学研讨简报，2008，36（3）：365-368.
[6] 兰才.桑叶总黄酮提取工艺的优选研讨[J].安徽农业科学，2013，41（3）：1260，1280.
[7] 章华伟，陈星宇，凌春英.呼应曲面优化醇法提取桑叶黄酮工艺研讨[J].氨基酸和生物资源，2010，34（3）：76-79.
[8] 薛淑萍，张立伟.正交实验法纯化桑叶中黄酮类化合物研讨[J].山西师范大学学报，2011，25（2）：93-94.
[9] 朱欣婷.大孔树脂纯化桑叶总黄酮的工艺条件研讨[J].安徽农业科学，2008，36（26）：11397-11398，11405.
[10] 陈菁菁，李向荣，方晓.大孔吸附树脂别离纯化桑叶总黄酮及其动力学研讨[J].浙江大学学报（医学版），2006， 35（2）：219-223.
（收稿日期：2013-11-13 本文修改：郭静娟）
成果表明，芦丁对照品在质量为0.1266～1.5192 mg范围内呈杰出的线性关系（表1），得回归方程为Y=0.3943X+0.0195，r=0.9999。
表1 芦丁规范曲线的制作
2.2.3 样品含量测定成果 称取各工艺制备的桑叶总黄酮1.0 g，置25 ml容量瓶中，加稀乙醇适量，超声处理30 min，冷却后加稀乙醇定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精细量取供试品溶液2 ml，置25 ml量瓶中，照规范曲线的制备项下的办法，自“加水至6 ml”起，依法测定吸光度，一起精细量取供试品溶液2 ml，置25 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为空白溶液。从规范曲线上读出供试品溶液中芦丁的量，核算，即得（表2）。
表2 不同纯化工艺制备的总黄酮收率和含量测定成果
2.2.4 准确度实验 选用加样收回法，取醇提-水沉-醇沉法所得样品（含总黄酮18.5%），称量6份，每份0.5 g，精细称定，别离精细参加芦丁对照品溶液（0.092 89 g/ml）1 ml，别离按“2.2.3”办法操作，测定每份总黄酮含量（表3）。成果表明，收回率均在95%～105%内，RSD=2.34%（<3%），契合办法学要求。
表3 准确度实验的成果
3 评论
从不同纯化工艺制备的桑叶总黄酮含量的测定成果剖析，乙酸乙酯萃取法的纯化作用较好，总黄酮含量最高，可是收率太低，阐明大部分黄酮类化合物没被保存下来，这样的工艺和成果在实践出产上不可取；大孔树脂吸附法的总黄酮含量也较高，尤其是D101型和JD-1型大孔树脂，可以使总黄酮含量达50%以上，可是收率较低，且出产工艺杂乱，操作繁琐，不契合工艺简洁廉价的要求；醇提-水沉-醇沉法，总黄酮含量契合15%以上的要求，收率高，工艺廉价简洁，因而更适于实践出产。
此外，本实验还为出产上制备各种含量的桑叶总黄酮供给了一个参阅，依据总黄酮的含量需求可选择相应的纯化工艺。
[参阅文献]
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：我国医药科技出版社，2010：279，372-373.
[2] 张艳艳，蒲秋燕，黄平，等.秦巴山区桑叶中芦丁提取工艺优化[J].安徽农业科学，2011，39（22）：13372-13373.
[3] 薛淑萍，张立伟.桑叶中总黄酮类化合物的提取工艺的优化[J].我国生化药物杂志，2010，31（6）：405.
[4] 贺伟强，向天勇，陶昆，等.呼应面法优化超声辅佐提取桑叶总黄酮的工艺研讨[J].我国农学通报，2012，28（33）：296-301.
[5] 励建荣，韩晓祥.超高压提取桑叶芦丁[J].剖析化学研讨简报，2008，36（3）：365-368.
[6] 兰才.桑叶总黄酮提取工艺的优选研讨[J].安徽农业科学，2013，41（3）：1260，1280.
[7] 章华伟，陈星宇，凌春英.呼应曲面优化醇法提取桑叶黄酮工艺研讨[J].氨基酸和生物资源，2010，34（3）：76-79.
[8] 薛淑萍，张立伟.正交实验法纯化桑叶中黄酮类化合物研讨[J].山西师范大学学报，2011，25（2）：93-94.
[9] 朱欣婷.大孔树脂纯化桑叶总黄酮的工艺条件研讨[J].安徽农业科学，2008，36（26）：11397-11398，11405.
[10] 陈菁菁，李向荣，方晓.大孔吸附树脂别离纯化桑叶总黄酮及其动力学研讨[J].浙江大学学报（医学版），2006， 35（2）：219-223.
（收稿日期：2013-11-13 本文修改：郭静娟）
