吴雄健++郑虹+朱海燕+毛忠懿+张蕾++谢军
[摘要]意图 探討骨髓间质干细胞移植后肝星状细胞凋亡状况及其医治肝纤维化的机制。办法 购买中山大学动物试验中心供给的30只清洁级SD大鼠，试验研讨选取20只，将提取骨髓间质干细胞的10只作为试验组，树立肝纤维化大鼠模型，骨髓干细胞发动干涉大鼠肝纤维化及肝星状细胞凋亡，检测肝纤维化及星状细胞凋亡目标；将未提取骨髓间质干细胞的10只作为对照组，不对其进行干涉。然后对骨髓间质干细胞的纯度判定成果进行剖析，并对两组大鼠的肝脏羟脯氨酸含量、肝星状细胞激活及凋亡状况进行统计剖析。成果 CD34、CD44、CD45、CD95阴性细胞分别为99.75%、99.51%、99.80%、95.72%。试验组大鼠CCl4皮下打针诱导8周后的肝脏羟脯氨酸含量明显高于骨髓间质干细胞移植前（P<0.05）；试验组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝脏羟脯氨酸含量明显低于骨髓间质干细胞移植3 d后（P<0.05），对照组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝脏羟脯氨酸含量明显高于骨髓间质干细胞移植3 d后（P<0.05）；试验组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝脏羟脯氨酸含量明显低于对照组（P<0.05）。试验组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝星状阳性细胞数明显少于骨髓间质干细胞移植3 d后（P<0.05）；试验组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝星状阳性细胞数明显少于对照组（P<0.05）。试验组大鼠骨髓间质干细胞移植3 d后的肝星状凋亡细胞数明显多于骨髓间质干细胞移植前及对照组（P<0.05）。定论 骨髓间质干细胞移植后诱导肝星状细胞凋亡可能是其医治肝纤维化的一个首要机制。
[关键词]骨髓间质干细胞移植；肝星状细胞；凋亡状况；肝纤维化；医治机制
[中图分类号] R575.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）07（c）-0107-04
Exploration of the apoptosis of hepatic stellate cells after bone marrow mesenchymal stem cell transplantation and its mechanism in the treatment of hepatic fibrosis
WU Xiong-jian1 ZHENG Hong2 ZHU Hai-yan1 MAO Zhong-yi1 ZHANG Lei1 XIE Jun1
1.Department of Gastroenterology，the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Jiangxi Province，Ganzhou 341000，China；2.Gannan Medical University，Jiangxi Province，Ganzhou 341000，China
[Abstract]Objective To investigate the apoptosis of hepatic stellate cells after bone marrow mesenchymal stem cell transplantation and its mechanism in the treatment of hepatic fibrosis.Methods 30 clean SD rats were purchased from Animal Experimental Center，Zhongshan University，and 20 of them were prepared for experimental research.Only ten rats whose bone marrow mesenchym stem cells were extracted and selected as the experimental group for the establishment of rat model with hepatic fibrosis.The hepatic fibrosis and apoptosis of hepatic stellate cells were intervened by bone marrow stem cell mobilization to test these indices.Another group without extraction of bone marrow mesenchymal stem cells was classified into the control group （n=10），which was not performed with intervention.The purity identification of bone marrow mesenchymal stem cells was analyzed，and the hydroxyproline content as well as hepatic stellate cell activation and apoptosis were statistically analyzed.Results The percentage of CD34，CD44，CD45 and CD95 in negative cells were 99.75%，99.51%，99.80% and 95.72%，respectively.After 8-week induction via subcutaneous injection of CCl4，the content of hydroxyproline in the rat′s liver in the experimental group was significantly higher than that before transplantation （P<0.05）.In the experimental group，the content of hydroxyproline in the liver after one-week bone marrow mesenchymal stem cell transplantation was much lower compared with that 3-day after transplantation （P<0.05）.In the control group，the content of hydroxyproline in the liver after one-week bone marrow mesenchymal stem cell transplantation was greatly higher in comparison with that 3-day after transplantation （P<0.05）.The content of hydroxyproline in the liver after one-week bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in the experimental group was remarkably lower than that in the control group （P<0.05）.The amount of hepatic stellate positive cells in the experimental group one-week after bone marrow mesenchymal stem cell transplantation was greatly less than that in the control group （P<0.05）.The amount of hepatic stellate apoptotic cells 3-day after bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in the experimental group was remarkably more than that before transplantation and in the control group （P<0.05）.Conclusion The hepatic stellate cell apoptosis induced by bone marrow mesenchymal stem cells may be a major mechanism for the treatment of hepatic fibrosis.
[Key words]Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation；Hepatic stellate cells；Apoptosis；Hepatic fibrosis；Treatment mechanism
肝纤维化归于一种病理体现，各种缓慢肝病向必定阶段开展后均会体现出来，现阶段，临床还没有特异性的办法医治肝纤维化及其终末阶段的肝硬化。在肝纤维化发作及缓解中，肝星状细胞激活及凋亡反常占有极为重要的位置。近年来，相关医学研讨显现，在肝纤维化或肝硬化的医治中，骨髓间质干细胞可以将必定的效果发挥出来，可是现阶段临床还未弄清楚其详细机制[1-2]。为了将有用的理论依据进一步供给给骨髓间质肝细胞对肝纤维化的医治，本研讨探讨了骨髓间质干细胞移植后肝星状细胞凋亡状况及其医治肝纤维化的机制，现报导如下。
1材料与办法
1.1材料
购买中山大学动物试验中心供给的30只清洁级SD大鼠，男女不限，一切大鼠均共同养殖于中山大学动物试验中心SPF层流环境中，均食用一般饲料、自在饮水。试验研讨选取20只，体质量180～200 g，均匀（190±10）g；提取骨髓间质干细胞10只，体质量80～100 g，均匀（90±10）g。选用GIBCO公司出产的L-DEME培育液、Pharmacia公司出产的密度为1.077 g/ml的percoll淋巴细胞别离液、Thermo公司出产的小鼠抗大鼠α-SMA 抗体及电热恒温CO2培育箱、hyclone公司出产的胎牛血清、santa公司出产的抗小鼠IgG-FITC荧光二抗、Roche公司出产的TUNEL试剂盒、福建迈新生物科技有限公司出产的免疫安排化学二抗试剂盒、南京建成生物工程研讨所出产的羟脯氨酸测验盒。
1.2办法
试验研讨选取20只，将提取骨髓间质干细胞的10只作为试验组，树立肝纤维化大鼠模型，骨髓干细胞发动干涉大鼠肝纤维化及肝星状细胞凋亡，检测肝纤维化及星状细胞凋亡目标；将未提取骨髓间质干细胞的10只作为对照组，不对其进行干涉，详细操作如下。
1.2.1肝纤维化大鼠模型的树立 选用40%四氯化碳（CCl4）溶液0.2 ml/100 g大鼠体重，皮下打针，每周2次，共6周，以树立大鼠肝纤维化模型；对照组选用等量的石蜡油替代CCl4溶液，处理办法相同。处死部分动物，留取标本，检测肝纤维化的开展状况。
1.2.2骨髓干细胞发动干涉大鼠肝纤维化及肝星状细胞凋亡 肝纤维化大鼠模型树立后立刻皮下打针经稀释的重组人粒细胞影响因子（rhG-CSF）30 μg/（kg·d）以发动骨髓干细胞，接连7 d；对照组也于肝纤维化大鼠模型树立后立刻皮下打针等量生理盐水替代rhG-CSF，接连7 d。
1.2.3肝纤维化及星状细胞凋亡目标的检测 于发动后第0、7、14、28天，以过量戊巴比妥钠麻醉处死大鼠，从心脏取全血2～3 ml，离心别离血清，-80℃冻存，选用化学发光法检测血清层黏蛋白（LN）、血清Ⅲ型前胶原（PⅢP）、血清Ⅳ型胶原（ⅣC）、透明质酸（HA）等肝纤维化目标；全自动生化仪检测大鼠血清总胆红素（TBiL）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平。取大鼠肝脏安排作Masson三色染色及惯例HE染色并进行图画剖析，对肝安排纤维化程度及胶原纤维百分比进行调查；检测α-SMA表达及肝星状细胞的活化状况，在此过程中使用免疫组化法，α-SMA与TUNE双染法检测肝星状细胞的凋亡状况；分光光度法检测肝脏羟脯氨酸（Hyp）的含量；流式细胞仪检测活化的肝星状细胞凋亡的改变。
1.3调查目标
对两组大鼠的肝安排羟脯氨酸的含量、病理状况、肝星状细胞激活及凋亡状况进行调查和记载。
1.4 统计学剖析
选用SPSS 20.0统计学软件对数据进行剖析，计量材料选用均数±标准差（x±s）表明，选用t查验，计数材料选用χ2查验，以P<0.05为差异有统计学含义。
2成果
2.1骨髓间质干细胞的纯度判定成果剖析
CD34、CD44、CD45、CD95阴性细胞分别为99.75%、 99.51%、99.80%、95.72%。
2.2两组大鼠肝脏羟脯氨酸含量的比较
试验组大鼠CCl4皮下打针诱导8周后的肝脏羟脯氨酸含量明显高于骨髓间质干细胞移植前（P<0.05）；试验组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝脏羟脯氨酸含量明显低于骨髓间质干细胞移植3 d后（P<0.05），对照组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝脏羟脯氨酸含量明显高于骨髓间质干细胞移植3 d后（P<0.05）；两组大鼠骨髓间质干细胞移植3 d后的肝脏羟脯氨酸含量比较，差异无统计学含义（P>0.05）。试验组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝脏羟脯氨酸含量明显低于对照组（P<0.05）（表1）。
2.3两组大鼠肝星状细胞激活及凋亡状况的比较
试验组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝星状阳性细胞数明显少于骨髓间质干细胞移植3 d后（P<0.05），对照组大鼠骨髓间质干细胞移植3 d后与骨髓间质干细胞移植1周后的肝星状阳性细胞数比较，差异无统计学含义（P>0.05）；两组大鼠骨髓间质干细胞移植3 d后的肝星状阳性细胞数比较，差异无统计学含义（P>0.05），试验组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝星状阳性细胞数明显少于对照组（P<0.05）。试验组大鼠骨髓间质干细胞移植3 d后的肝星状凋亡细胞数明显多于骨髓间质干细胞移植前及对照组（P<0.05），两组大鼠骨髓间质干细胞移植前的肝星状凋亡细胞数比较，差异无统计学含义（P>0.05）（表2）。
3评论
现阶段，临床还没有特异性的办法医治肝纤维化及其终晚期的肝硬化，在肝纤维化的发作及反转过程中，肝星状细胞激活及凋亡发挥着极为重要的效果[3]。相关医学研讨显现，各种损害要素在肝脏效果后可以将肝星状细胞激活，进而构成其很多增殖，终究引发纤维化[4]。对肝星状细胞凋亡进行诱导可以对肝纤维化进行缓解[5]，而肝星狀细胞凋亡水平在试验性肝纤维化大鼠自发反转过程中跟着纤维化反转程度的加重而提高，跟着纤维化反转程度的减轻而下降，两者呈明显的正相关联系[6]。
近年来，相关医学研讨显现，在纤维化疾病的医治中，骨髓间质干细胞可以将必定的效果发挥出来[7-8]。也有相关医学研讨显现，肝脏炎症损害的发作遭到打针间充质干细胞后归巢于肝脏的直接而深入的影响，可是并不受门静脉或外周静脉等打针途径的直接而深入的影响[9]。相关医学学者以为，磷酸鞘氨醇介导了间充质干细胞归巢于肝脏[10]。尽管也有相关医学学者提出，骨髓干细胞移植后可以为肝脏内肌成纤维细胞及肝星状细胞的构成供给杰出的前提条件，其具有瘢痕构成功用，从而使肝纤维化加重[11]。本研讨成果显现，CD34、CD44、CD45、CD95阴性细胞分别为99.75%、99.51%、99.80%、95.72%。CCl4皮下打针诱导8周后两组大鼠的肝脏羟脯氨酸含量明显高于骨髓间质干细胞移植前（P<0.05）；试验组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝脏羟脯氨酸含量明显低于骨髓间质干细胞移植3 d后（P<0.05），对照组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝脏羟脯氨酸含量明显高于骨髓间质干细胞移植3 d后（P<0.05）；两组大鼠骨髓间质干细胞移植3 d后的肝脏羟脯氨酸含量比较，差异无统计学含义（P>0.05），骨髓间质干细胞移植1周后试验组大鼠的肝脏羟脯氨酸含量明显低于对照组（P<0.05），与上述相关医学研讨成果共同。
间充质干细胞可以向干细胞分解，参加肝脏损害修正，改进肝功用，但这可能不是其对肝纤维化进行缓解的首要效果机制。由于肝脏本身较为特别，本身老练肝细胞割裂增殖完成了大多数的损害修正及再生，一起，在肝细胞的再生过程中，纤维化过程中堆积下来的过量细胞外基质并不会随之降解，因而，应该有其他更为重要的基质发挥效果。临床很有必要对肝星状细胞和间充质干细胞之间的相互效果进行研讨，这是由于在肝纤维化的发作、开展过程中，肝星状细胞发挥着极为重要的效果[12-15]。本研讨成果显现，试验组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝星状阳性细胞数明显少于骨髓间质干细胞移植3 d后（P<0.05），但对照组大鼠骨髓间质干细胞移植3 d后、骨髓间质干细胞移植1周后的肝星状阳性细胞数比较，差异无统计学含义（P>0.05）；两组大鼠骨髓间质干细胞移植3 d后的肝星状阳性细胞数比较，差异无统计学含义（P>0.05），试验组大鼠骨髓间质干细胞移植1周后的肝星状阳性细胞数明显少于对照组（P<0.05）。试验组大鼠骨髓间质干细胞移植3 d后的肝星状凋亡细胞数明显多于骨髓间质干细胞移植前及对照组（P<0.05），两组大鼠骨髓间质干细胞移植前的肝星状凋亡细胞数比较，差异无统计学含义（P>0.05），提示间充质干细胞可以对肝纤维化进程进行缓解，一起也可以在必定程度上对炎症进行按捺，减轻炎症因子损害干细胞程度，并为其再生供给杰出的前提条件。
综上所述，骨髓间质干细胞移植后诱导肝星状细胞凋亡可能是其医治肝纤维化的一个首要机制，值得临床充沛注重。
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（收稿日期：2017-06-02 本文編辑：祁海文）
