齐悦 朱涛 覃志成
[摘要]意图 觀察核因子κB受体活化因子配体（RANKL）对血管严重素Ⅱ（AngⅡ）诱导的人肾足细胞排泄血管内皮细胞生长因子（VEGF）的影响，探求AngⅡ是否经过RANK/RANKL信号通路影响足细胞表达VEGF。办法 以分解为树枝状的人肾足细胞为研讨目标，以不同浓度（0、1、10、100 nmol/L）的AngⅡ处理，别离于不一同刻（0、6、12、24 h）经过实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测基因VEGF、RANK和RANKL的mRNA表达改变。然后以不同剂量的RANKL与100 nmol/L AngⅡ一同影响足细胞24 h后，经过RT-PCR检测VEGF的mRNA表达改变，流式细胞术检测足细胞凋亡率改变。成果 AngⅡ呈剂量和时刻依靠性地诱导足细胞表达VEGF、RANK和RANKL（P<0.05），而过量RANKL表现出剂量依靠性地阻断VEGF表达增高 （P<0.05）；与对照组比较，AngⅡ能够显着诱导足细胞凋亡（P<0.05），而RANKL能够按捺由AngⅡ诱导的足细胞凋亡（P<0.05）。定论 AngⅡ可能经过RANK/RANKL信号通路影响足细胞表达VEGF，RANKL经过反响调理下调VEGF基因表达来按捺AngⅡ引起的足细胞凋亡，维护肾脏。
[要害词]足细胞；血管严重素Ⅱ；核因子κB受体活化因子配体；血管内皮细胞生长因子
[中图分类号] R692.6 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）5（b）-0013-05
Effect of receptor activator of nuclear factor-κB ligand on the secretion of vascular endothelial cell growth factor from human glomerular podocytes induced by angiotensinⅡ
QI Yue1 ZHU Tao2 QIN Zhi-cheng3
The Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China
[Abstract]Objective To investigate the effect of receptor activator of nuclear factor-κB ligand （RANKL） on the secretion of vascular endothelial growth factor （VEGF） induced by angiotensin Ⅱ （AngⅡ） in human renal podocytes，and to explore whether AngⅡaffecting VEGF expression in podocytes through RANK/RANKL signaling pathway.Methods The human renal podocytes differentiated into dendrites were selected as research subjects.They were dealt with AngⅡin different concentrations （0，1，10，100 nmol/L）.Real-time fluorescence quantitative PCR was performed at different time （0，6，12，24 h） to detect the changes in mRNA expression of the genes VEGF，RANK，and RANKL.Then podocytes were stimulated with different doses of RANKL and 100 nmol/LM AngⅡ for 24 h.The expression of VEGF mRNA was detected by RT-PCR and the apoptosis rate of podocytes was detected by flow cytometry.Results AngⅡ induced podocyte expression of VEGF，RANK，and RANKL in a dose-and time-dependent manner （P<0.05），while excess RANKL showed dose-dependent blockade of VEGF expression increasing （P<0.05）.Compared with the control group，AngⅡ significantly induced podocyte apoptosis （P<0.05），while RANKL inhibited podocyte apoptosis induced by AngⅡ （P<0.05）.Conclusion AngⅡ may affect podocyte expression of VEGF through RANK/RANKL signaling pathway.RANKL inhibits the apoptosis of the podocytes induced by AngⅡ by regulating the expression of VEGF gene through feedback regulation and protects the kidneys.
[Key words]Podocyte；Angiotensin Ⅱ；Receptor activator of nuclear factor-κB ligand；Vascular endothelial growth factor
足细胞（肾小球脏层上皮细胞，podocyte）作为肾小球的滤过屏障的重要组成部分，在多种要素的影响下可导致其损害，然后引起蛋白尿的发作和肾小球的硬化[1]。血管严重素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ），作为肾脏部分肾系血管严重素体系（renin-angiotensin system，RAS）的首要效应因子， 在间充质干细胞、小鼠和人足细胞等多种细胞中能诱导血管内皮细胞生长因子（VEGF）表达上调，p-38、Akt、ERK可能发挥着重要效果[2-5]。但AngⅡ与VEGF在人足细胞中的效果机制仍有许多不明之处还需进一步研讨。
Liu等[6]的研讨发现一条和炎症相关的新信号通路介导足细胞损害，即肿瘤坏死因子宗族的核因子κB受体活化因子（receptor activator for nuclear factor-κB，RANK）信号，RNAK的配体（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）能够阻抑凋亡，维护足细胞。前期试验已发现AngⅡ能够经过p38MAPK信号通路诱导足细胞表达VEGF[7]，估测在人肾小球足细胞中是否也存在相似AngⅡ-RANK/RANKL-VEGF的通路，调理足细胞的功用，故本试验拟对AngⅡ诱导足细胞表达VEGF的改变及其与RANK/RANKL信号通路的联系进行研讨，以进一步清晰AngⅡ诱导足细胞表达VEGF的效果机制及其对足细胞的维护效果，为将来药物干涉供给研讨根底。
1 材料与办法
1.1 首要试剂
RPMI-1640培育基（美国GIBCO公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；1% ITS（胰岛素10 μg/ml、转铁蛋白5.5 μg/ml、亚硒酸钠5 ng/ml，美国Sigma公司）；青霉素（华北制药）；AngⅡ （美国Sigma公司）；RANKL（美国R&D; Systems公司）； Trizol液（美国Promega公司）；引物 （上海生工公司）；RNA 提取试剂盒 （美国Omega公司）；反转录试剂盒（Prie Script TMRT-PCR kit，宝生物工程有限公司）；SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（宝生物工程有限公司）；实时荧光定量PCR仪（瑞士Roche公司）。
1.2 足细胞培育
人肾小球足细胞由英国Bristol大学Saleem教授赠送，按参考文献[8]的办法培育。足细胞复苏后在含1% ITS的RPMI-1640培育液（10%胎牛血清）中，于33℃ 、5%CO2培育箱中培育，用含0.05%胰蛋白酶的消化液消化传代，然后转入37℃、5%CO2培育箱分解14 d。选取在37℃条件下分解为树枝状的人肾足细胞为研讨目标。
1.3试验分组
AngⅡ浓度梯度对人肾小球足细胞表达基因VEGF、RANK和RANKL的影响：细胞各组中别离参加AngⅡ，其终浓度别离为0、1、10、100 nmol/L，培育24 h后搜集细胞。AngⅡ时刻梯度对人足细胞VEGF、RANK和RANKL基因表达的影响：用100 nmol/L AngⅡ影响VEGF基因表达的最佳浓度干涉细胞，别离培育0、6、12、24 h。RANKL对AngⅡ诱导人肾小球足细胞表达VEGF的影响：用AngⅡ（100 nmol/L）参加不同剂量的RANKL（0、20、40、80 ng/ml）干涉足细胞24 h，一同设置正常组（不加AngⅡ和RANKL）。
1.4 RNA提取和半定量RT-PCR
用Trizol法提取总RNA进行RT-PCR检测，以GAPDH作为内参基因，选用2-ΔΔCT法进行相对定量。严厉依照RT-PCR相关试剂盒阐明书进行操作，提取RNA，反转录成cDNA，用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒在Roche 480仪器上进行PCR检测。PCR反响条件为：95℃ 30 s，95℃ 10 s，60 ℃ 20 s（35 cycles）。各基因引物序列见表1。
1.5 AngⅡ和 RANKL干涉对足细胞凋亡率的影响
试验分三组：别离以100 nmol/L 的AngⅡ独自影响足细胞，100 nmol/L的AngⅡ和80 ng/ml的 RANKL一同处理足细胞24 h，一同设置空白对照组。胰酶消化搜集细胞，PBS洗刷细胞2次，运用凋亡检测试剂盒進行FITC和PI双染15 min，30 min内经过流式细胞仪测定细胞凋亡状况。
1.6 统计学剖析
选用SPSS 16.0软件剖析数据，计量材料用均数±标准差（x±s）标明，选用单要素方差剖析（one-way AVONA）和Turkey查验，以P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 不同剂量AngⅡ对人肾足细胞VEGF、RANK和RANKL mRNA表达水平的影响
RT-PCR检测成果显现，以不同浓度AngⅡ影响肾足细胞24 h后，VEGF、RANK和RANKL mRNA表达均呈剂量依靠性升高。如图1所示，与空白组比较，较大剂量组（10、100 nmol/L AngⅡ）的VEGF、RANK和RANKL mRNA表达量显着上升，差异有统计学含义（P<0.05）。
2.2 AngⅡ影响不一同刻对人肾足细胞VEGF、RANK和RANKL mRNA表达水平的影响
在AngⅡ（100 nmol/L）影响肾足细胞0、6、12、24 h后，VEGF、RANK和RANKL mRNA表达均呈时刻依靠性升高。与对照组（0 h）比较， VEGF、RANK和RANKL mRNA表达量均随干涉时刻添加而出现显着的上升趋势（P<0.05）（图2）。
2.3 RANKL对经AngⅡ诱导的足细胞表达VEGF的影响
与空白组比较，经AngⅡ 100 nmol/L影响，不添加RANKL的对照组的VEGF mRNA表达添加（P<0.01）。经RANKL干涉的足细胞，VEGF mRNA的表达遭到按捺，且出现剂量依靠性按捺。小剂量组（20 ng/ml）与对照组比较，差异无统计学含义（P>0.05）。但随着RANKL剂量的增大，VEGF mRNA表达显着下调（P<0.05）（图3），提示在AngⅡ诱导的足细胞中，RANKL影响mRNA的表达，与VEGF mRNA的表到达负相关。
2.4 AngⅡ和 RANKL干涉对足细胞凋亡率的影响
搜集细胞，运用BD Accuri C6流式细胞仪进行细胞凋亡率检测，并进行方差剖析。与空白组（0.4±0.1）%比较，对照组（AngⅡ 100 nmol/L）的凋亡率为（28.34±2.2）%，阐明AngⅡ能够显着诱导足细胞凋亡。AngⅡ+RANKL组的细胞凋亡率为（11.14±1.06）%，与AngⅡ比较，差异有统计学含义（P<0.05）（图4），提示RANKL能够按捺AngⅡ诱导的足细胞凋亡。
3 评论
蛋白尿是简直一切肾小球疾病的一同临床表现之一，它不仅是肾小球滤过屏障受损的标志，并且它与肾小球疾病的开展密切相关，是肾小球疾病开展的独立风险要素。足细胞是附着在肾小球基底膜（GBM）外侧高度分解的细胞[9]，作为肾小球固有细胞之一，连同GBM和毛细血管内皮细胞一同，构成肾小球血液滤过屏障[10]。作为血液滤过的终究屏障，足细胞已经成为针对蛋白尿研讨的要害细胞。现在很多研讨以为，足细胞损害是肾小球损害的中心环节，能够直接导致蛋白尿的发作及肾小球的硬化。因而，研讨足细胞然后提醒蛋白尿发作的机制具有重要含义。
VEGF是一种二聚体糖蛋白，是内皮特异性的有丝分裂原，在肾脏首要表达于足细胞的足突，有添加血管通透性、促进内皮细胞增生和血管构成效果。而VEGF受体则以跨膜蛋白的方法表达于肾小球内皮细胞外表，足细胞能够经过旁表达的方法调理内皮功用，是内皮细胞重要的调控因子[11]。肾小球足细胞和内皮细胞是构成滤过膜的重要成分，VEGF能削减GBM阴离子数而影响电荷屏障，并经过影响肾小球内皮细胞而调理机械屏障，因而VEGF被以为是调理肾小球通透性的重要因子，在肾病开展中扮演着重要的人物[12]。很多依据标明，VEGF与蛋白尿的构成密切相关[13]，VEGF的反常表达添加可导致肾小球滤过膜通透性添加，促进蛋白尿的构成。
肾脏部分的RAS在缓慢肾脏病变的发作开展中的重要效果越来越遭到人们的重视，RAS的首要效应因子AngⅡ 与许多肾脏疾病的开展过程密切相关[14-15]。研讨标明，AngⅡ能够诱导肾脏内生性VEGF的发作[5]。此外，Ren等[16]的研讨发现，AngⅡ以剂量依靠方法诱导培育的足细胞以及动物模型足细胞凋亡。本研讨也发现，AngⅡ能够诱导足细胞凋亡，可是过量的RANKL会按捺AngⅡ诱导的足细胞凋亡。足细胞作为血液滤过的终究屏障，其凋亡必然会添加肾小球滤过膜的通透性，引起蛋白尿的构成。因而，保持VEGF正常水平缓足细胞的数量，能够维护肾小球，防止蛋白尿的发作。
RANK及其RANKL是肿瘤坏死因子（TNF）及其受体超宗族的成员。以往对RANK和RANKL的研讨首要会集在骨质疏松及骨肿瘤性疾病中。大多数学者以为RANK/RANKL/OPG通路是成骨细胞和破骨细胞之间进行对话的重要信号通路， RANKL结合RANK后经过调控NF-κB和MAPK通路促进破骨细胞的分解与活化引起骨质的损坏[17]。近年有研讨标明，RANK和RANKL参加缓慢肾脏疾病的发作与开展。Liu等[6，18]在肾小球硬化性肾病、IgA肾病、膜性肾病等患者肾脏中发现RANK和RANKL的高表达，且RANK特异性表达于足细胞。Chen等[19]体表里研讨发现，RANK和RANKL介导NF-κB通路和MAPK通路活化，促进足细胞损害，加速肾脏疾病的发作与开展。
本研讨发现，AngⅡ以时刻和剂量依靠性的上调VEGF基因的表达，这与Pupilli等[20]的研讨成果相似。此外，AngⅡ还能引起RANK和RANKL基因水平的表达上调。当足细胞中参加过量外源性的RANKL时，VEGF的基因水平表达下调，终究引起足细胞凋亡率削减。上述两方面试验成果阐明，RANKL与VEGF存在直接的相互联系，处于同一个通路AngⅡ-RANK/RANKL-VEGF中。当AngⅡ含量升高，影响足细胞表达过多的VEGF，能导致蛋白尿的发作。而AngⅡ还能引起RANK/RANKL的表达升高。但当RANKL到达必定浓度后，能下调VEGF的表达水平，构成反响调理。因而，AngⅡ和RANK/RANKL兩者经过必定的平衡状况一同调理VEGF的表达，保持肾脏的正常功用。本文的研讨提示AngⅡ和RANK/RANKL两者一同保持VEGF表达水平，防止足细胞凋亡，为将来药物干涉医治尿蛋白供给了研讨根底。
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（收稿日期：2018-03-06 本文修改：许俊琴）
