肠道病毒71型:长江中下游三所城市143例71型肠道病毒的基因特征剖析

来源:中国现代医生 ·2018年12月31日 09:53 浏览量:0

陈谨+程险峰+江炳福+詹圣伟+朱明+郑秀丽+陈道利

[摘要] 意图 了解长江中下游三城市肠道病毒71型(EV71)基因型的散布情况。办法 使用逆转录半巢式PCR的办法检测三所城市143份临床确诊为手足口病患儿的血清和咽拭子标本。 成果 143份标本中检测到阳性EV71 RNA33份(23%);经过测序证明33份标本均为EV71 C4型。 定论 三所城市的手足口病首要由C型 EV71病毒引起。不同城市间EV71病毒存在必定的变异。

[关键词] EV71;RT-PCR;手足口病;基因型

[中图分类号] R373[文献标识码] B[文章编号] 1673-9701(2014)19-0076-03

The analysis of genic characteristics of 143 cases of enterovirus 71 in 3 cities of the middle and lower reaches of Changjiang River

CHEN Jin1 CHENG Xianfeng1 JIANG Bingfu2 ZHAN Shengwei1 ZHU Ming1 ZHENG Jinxiu1 CHEN Daoli1

1.Maanshan Center for Disease Control and Prevention in Anhui Province, Maanshan 243000, China; 2. Medical College of Dongnan University, Nanjing 210009, China

[Abstract] Objective To investigate the EV71 genotypes in 3 cities of the middle and lower reaches of Changjiang River. Methods EV71 RNA was detected in 143 samples from the hospitals with reverse translation polymerase chain reaction. Results There were 33 (23%) positive products. After the 33 positive products were sequenced, the results showed that they were all C4 genotype EV71. Conclusion It seems that the HFMDs are mainly infected by the C4 genotype EV71 in these areas. This study indicates that the current C4 genotype EV71 varied significantly in different cities.

[Key words] EV71; RT-PCR; Hand-foot-mouth disease; Genotype

人类肠道病毒71 型(EV71)归于肠病毒属A型,是柯萨奇病毒A16(CA16)的近亲, 其感染后首要引起手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)、疱疹性咽峡炎、无菌性脑膜炎及脑炎等临床症状。EV71急性感染还简单构成严峻的神经系统疾病,重症患者病死率可达10%~25%,这一点与CA16不同[1]。1997年以来,EV71病毒的盛行在亚太区域呈显着上升趋势。其间,1998年和2000年台湾有过两次EV71大盛行,别离有129 106和80 677人患病,78、41人逝世[2]。我国深圳2003年也呈现EV71爆发疫情[3],2008年3~4月间我省阜阳市发作儿童感染EV71疫情,逝世总人数到达36人[4]。

有研讨使用VP1序列的差异对EV71型病毒进行的一项分子盛行病学查询发现[5],EV71型病毒又可分为A、B、C三个亚型。在亚型中,B型和C型又能够分红B1~B5和C1~C5。各地盛行的EV71病毒株存在差异,1970年美国加利福尼亚别离出的EV71毒株归于A型;随后,美国、哥伦比亚及澳大利亚等地成功别离出EV71毒株的亚型EB型。1997~2000年,亚太区域盛行的EV71归于B3、B4、C1和C2型[6],而2008年安徽省阜阳市盛行的毒株则为C4型。

为了了解长江中下游三城市EV71盛行毒株的基因型别,咱们经过RT-nPCR技能(逆转录-半巢式聚合酶链反响)对143个疑似手足口病的样本的咽拭子标本进行了检测,并对不同城市之间盛行的毒株是否为同源毒株进行了剖析。

1 资料与办法

1.1 一般资料

咽拭子标本共143份,来源于2012年5~7月安徽马鞍山市、芜湖市和南京市各医院收治的手足口病患儿。手足口病确诊规范依据《手足口病防备操控攻略》(2008年版)。

1.2 EV71代表株的基因序列

在GenBank中查询13株EV71毒株的VP1序列,其间11株包含A、B、C型及其亚型,为部分基因序列。剩下2株为全基因序列。

1.3 引物的规划

以GenBank中的EV71基因序列为参照,经过不同的基因型以及亚型的保存区组成相关引物。详细引物序列如下:第一轮:5-CCRGTAGGKGTRC ACGCRAC-3, 5-GTTCTTAACTCACATAGCA-3;第二轮:5-TTGACAAAAACTGAGGGGTT-3,5-GTTCTTAACTC ACATAGCA-3。由于引物坐落EV71 的VP1区域,所以能愈加有效地扩增EV71 A、B、C亚型的基因片段[7]。

1.4 RNA抽提及半巢氏RT-PCR检测

取200 μL咽拭子依照Rneasy Mini Kit(Qiagen)中说到的操作阐明进行病毒RNA的提取。所提取RNA于-70℃进行保存或许马上进行反转录试验。以阴性作为试验对照,RT-PCR反响选用一步法RT-PCR试剂盒(Qiagen)进行扩增。第一轮的反响环境为:42℃下逆转录(45 min),94℃下预变性(4 min);第一轮的PCR反响环境:94℃下变性(30 s),50℃下退火(25 s),72℃下延伸(70 s),总共35个循环周期;72℃下再延伸(10 min)。第二轮的PCR反响温度依次为:50℃(30 min),94℃(2 min),94℃(30 s),48℃(30 s),72℃(40 s),总共35个循环周期。

1.5 测序与剖析

经过纯化试剂盒对PCR阳性产品进行测序,该进程由上海英骏生物公司完结。使用分子生物学软件MEGA4.1和DNASTAR进行序列的遗传间隔核算、同源性比较以及基因的进化树制作,办法参照相关文献[8]。

2 成果

2.1 EV71 RNA的检测

对三个城市临床确诊为手足口病患儿的143份咽拭子标本进行EV71病毒的 RNA检测。成果显现共有33份阳性标本,阳性率为31%。部分阳性标本的PCR产品的电泳图谱见图1。

1. DNA分子量规范;2. 阴性对照;3. MAS-01;4. MAS-12;

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5.WUHU-01;6.NANJING-05

图1 马鞍山区域标本的PCR产品电泳图

2.2 同源性剖析

将33份纯化后的阳性标本的核苷酸序列与EV71病毒各基因型和亚型代表株的相应片段进行同源性比较(表1)。33株EV71病毒别离株与 CA16、A、B 基因型及亚型代表株的同源性差异较大,与CA16代表株核苷酸同源性仅为49.2%~53.4%,与C代表株同源性差异较小,为82.6%~98.6%。与 B基因型及其亚型代表株的同源性为78.1%~81.4%,与A代表株(U22521)的同源性为75.0%~79.3%;与C4基因亚型同源性最高,达92.1%~98.6%。马鞍山12株内部同源性最高,到达99.5%~100%,南京11株内部同源性为96.5%~100%,而芜湖10株同源性为96.3%~100%。三城市之间毒株比较发现,马鞍山与南京毒株间的同源性在92.5%~94.7%之间;马鞍山与芜湖毒株间的同源性较高,为96.3%~100%;而南京、芜湖毒株间的同源性最低,仅为89.8%~94.1%。

2.3基因分型

从基因进化树(图2)能够看到,CA16 U05876毒株单独成一分支,EV71 A型U22521株构成一个首要分支;AF376066、AF376117、U22522、AY905548、AY135873株则别离构成B1~B5亚型;33例阳性标本与来源于新加坡、台湾及阜阳的6个毒株构成一个分支,该分支较大。上述成果提示,33份标本归于C型EV71病毒,一起和阜阳EU703812毒株构成同一亚型,为EV71 C4b病毒。C型EV71分支中可持续分为5个亚型。其间AF135948 和AB552988一起构成一个亚型,为亚型C2。AF135932单独构成一个亚型,为亚型C1;阜阳株和咱们的研讨中发现的33株组成一个分支,为亚型C4。

3 评论

1969年EV71病毒初次从一名患有中枢神经系统疾病的婴儿中别离出。尔后全球范围内均有EV71病毒的相关盛行报导。曩昔40多年间,共三次全球大盛行。其间,我国台湾区域于1998年发作了HFMD的大盛行,共呈现病例为129 106例,其间严峻病例405例,逝世78例,大部分死由于肺水肿和肺出血,其间<5岁的逝世患儿占91%,其间48.7%的患者感染EV71[2]。

由于HFMD首要由EV71 和 CVA16 引起,但两者临床症状相似,难以区别,因而首要依托试验室确诊。现在试验室惯例确诊办法首要有免疫组化、病毒别离及中和抗体水平的检测。但是,这些办法需较大人力、物力及时刻,无法满意快速确诊和大样本的显现需求。研讨标明[9]肠道病毒(EV)的血清型与VP1基因序列密切相关,可用于判定 EV血清型;一起由于其存在最大的变异率,因而研讨人员使用这一点对EV病毒进行相关的分子盛行病学研讨。

本研讨以EV71病毒特异性片段为引物,扩增出 EV71 VP1区232bp的基因片段,然后到达快速确诊意图。本研讨对143份咽拭子标本进行了扩增,其间33份标本的PCR成果为阳性。一起,课题组对33株EV71病毒的特异性序列进行了相关的基因进化剖析。试验成果标明33株病毒与 A型及B型代表株存在较大差异,而与 C型代表株存在较高的同源性,特别与归于C4亚型毒株有很高同源性。

以往研讨以为各毒株基因型内部的差异>15%视

为一个新的基因型,而同源性<12%为亚型分型的规范[9]。试验中所别离的33株EV7病毒与C型病毒有82.6%~98.6%的同源性序列。因而依据上述规范,应该呈现新的病毒型或病毒亚型。但是从基因树的成果进行剖析,33株病毒仍旧为C型病毒。构成该现象发作的可能原由于:PCR扩增的序列片段较小,构成有较大差异的同源性现象的构成。当时国内对EV71的检测研讨所扩增的序列均为200~350 bp。因而,持续以之前的分型规范进行病毒分型值得商讨。

依据基因同源性的成果,咱们发现33株EV71别离株尽管均归于C4亚型,但不同城市所别离的毒株同源性并不高,存在较大变异。因而,对EV71分子盛行病学进行深化的研讨有利于咱们研发特异性强、灵敏度高的确诊试剂和EV71疫苗。

[参考文献]

[1]周晓凤,熊林. 重症手足口病并发脑炎患儿的护理干涉[J]. 我国现代医师, 2013,51(15):98-99.

[2]Ho M,Chen ER,Hsu KH,et al. An epidemic of enterovirus 71 infection in Taiwan[J]. N Engl J Med,1999,341(13):929-935.

[3]仇桂华,何燕平,刘艺颍,等. 重症手足口病(EV71感染)并发神经源性肺水肿患儿的急救与护理[J]. 安徽医学,2008,29(4):367-368.

[4]姜青松. 郑州市二七区2009年手足口病盛行病学剖析[J]. 我国现代医师,2011,49 (8):113-114.

[5]Brown BA,Oberste MS,Alexander JP,et a1. Molecular epi- demiology and evolution of entero- virus 71 strains isolated from 1970 to 1998 [J]. Virol,1999,73(12):9969-9975.

[6]王美芬,陈韬杜,曾庆,等. 2010年昆明及周边区域普通型与重型手足口病病原学剖析[J]. 我国有用医刊,2013, 40(1):30-32.

[7]崔爱利,许文波,李秀珠,等. 肠道病毒71型的RT-PCR确诊及基因特征[J]. 病毒学报, 2004,20(2):160-165.

[8]陈国兵,孟继鸿. 戊型肝炎病毒摩洛哥株非编码区基因序列判定及基因型分型[J]. 中华微生物学和免疫学杂志,2004,24(10):828-833.

[9]张颖,和鹏,陈纯,等. 广州市2011年柯萨奇病毒A组6型的分子盛行病学特征[J]. 中华盛行病学杂志,2014, 35(1):103-104.

(收稿日期:2014-03-26)

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图1 马鞍山区域标本的PCR产品电泳图

2.2 同源性剖析

将33份纯化后的阳性标本的核苷酸序列与EV71病毒各基因型和亚型代表株的相应片段进行同源性比较(表1)。33株EV71病毒别离株与 CA16、A、B 基因型及亚型代表株的同源性差异较大,与CA16代表株核苷酸同源性仅为49.2%~53.4%,与C代表株同源性差异较小,为82.6%~98.6%。与 B基因型及其亚型代表株的同源性为78.1%~81.4%,与A代表株(U22521)的同源性为75.0%~79.3%;与C4基因亚型同源性最高,达92.1%~98.6%。马鞍山12株内部同源性最高,到达99.5%~100%,南京11株内部同源性为96.5%~100%,而芜湖10株同源性为96.3%~100%。三城市之间毒株比较发现,马鞍山与南京毒株间的同源性在92.5%~94.7%之间;马鞍山与芜湖毒株间的同源性较高,为96.3%~100%;而南京、芜湖毒株间的同源性最低,仅为89.8%~94.1%。

2.3基因分型

从基因进化树(图2)能够看到,CA16 U05876毒株单独成一分支,EV71 A型U22521株构成一个首要分支;AF376066、AF376117、U22522、AY905548、AY135873株则别离构成B1~B5亚型;33例阳性标本与来源于新加坡、台湾及阜阳的6个毒株构成一个分支,该分支较大。上述成果提示,33份标本归于C型EV71病毒,一起和阜阳EU703812毒株构成同一亚型,为EV71 C4b病毒。C型EV71分支中可持续分为5个亚型。其间AF135948 和AB552988一起构成一个亚型,为亚型C2。AF135932单独构成一个亚型,为亚型C1;阜阳株和咱们的研讨中发现的33株组成一个分支,为亚型C4。

3 评论

1969年EV71病毒初次从一名患有中枢神经系统疾病的婴儿中别离出。尔后全球范围内均有EV71病毒的相关盛行报导。曩昔40多年间,共三次全球大盛行。其间,我国台湾区域于1998年发作了HFMD的大盛行,共呈现病例为129 106例,其间严峻病例405例,逝世78例,大部分死由于肺水肿和肺出血,其间<5岁的逝世患儿占91%,其间48.7%的患者感染EV71[2]。

由于HFMD首要由EV71 和 CVA16 引起,但两者临床症状相似,难以区别,因而首要依托试验室确诊。现在试验室惯例确诊办法首要有免疫组化、病毒别离及中和抗体水平的检测。但是,这些办法需较大人力、物力及时刻,无法满意快速确诊和大样本的显现需求。研讨标明[9]肠道病毒(EV)的血清型与VP1基因序列密切相关,可用于判定 EV血清型;一起由于其存在最大的变异率,因而研讨人员使用这一点对EV病毒进行相关的分子盛行病学研讨。

本研讨以EV71病毒特异性片段为引物,扩增出 EV71 VP1区232bp的基因片段,然后到达快速确诊意图。本研讨对143份咽拭子标本进行了扩增,其间33份标本的PCR成果为阳性。一起,课题组对33株EV71病毒的特异性序列进行了相关的基因进化剖析。试验成果标明33株病毒与 A型及B型代表株存在较大差异,而与 C型代表株存在较高的同源性,特别与归于C4亚型毒株有很高同源性。

以往研讨以为各毒株基因型内部的差异>15%视

为一个新的基因型,而同源性<12%为亚型分型的规范[9]。试验中所别离的33株EV7病毒与C型病毒有82.6%~98.6%的同源性序列。因而依据上述规范,应该呈现新的病毒型或病毒亚型。但是从基因树的成果进行剖析,33株病毒仍旧为C型病毒。构成该现象发作的可能原由于:PCR扩增的序列片段较小,构成有较大差异的同源性现象的构成。当时国内对EV71的检测研讨所扩增的序列均为200~350 bp。因而,持续以之前的分型规范进行病毒分型值得商讨。

依据基因同源性的成果,咱们发现33株EV71别离株尽管均归于C4亚型,但不同城市所别离的毒株同源性并不高,存在较大变异。因而,对EV71分子盛行病学进行深化的研讨有利于咱们研发特异性强、灵敏度高的确诊试剂和EV71疫苗。

[参考文献]

[1]周晓凤,熊林. 重症手足口病并发脑炎患儿的护理干涉[J]. 我国现代医师, 2013,51(15):98-99.

[2]Ho M,Chen ER,Hsu KH,et al. An epidemic of enterovirus 71 infection in Taiwan[J]. N Engl J Med,1999,341(13):929-935.

[3]仇桂华,何燕平,刘艺颍,等. 重症手足口病(EV71感染)并发神经源性肺水肿患儿的急救与护理[J]. 安徽医学,2008,29(4):367-368.

[4]姜青松. 郑州市二七区2009年手足口病盛行病学剖析[J]. 我国现代医师,2011,49 (8):113-114.

[5]Brown BA,Oberste MS,Alexander JP,et a1. Molecular epi- demiology and evolution of entero- virus 71 strains isolated from 1970 to 1998 [J]. Virol,1999,73(12):9969-9975.

[6]王美芬,陈韬杜,曾庆,等. 2010年昆明及周边区域普通型与重型手足口病病原学剖析[J]. 我国有用医刊,2013, 40(1):30-32.

[7]崔爱利,许文波,李秀珠,等. 肠道病毒71型的RT-PCR确诊及基因特征[J]. 病毒学报, 2004,20(2):160-165.

[8]陈国兵,孟继鸿. 戊型肝炎病毒摩洛哥株非编码区基因序列判定及基因型分型[J]. 中华微生物学和免疫学杂志,2004,24(10):828-833.

[9]张颖,和鹏,陈纯,等. 广州市2011年柯萨奇病毒A组6型的分子盛行病学特征[J]. 中华盛行病学杂志,2014, 35(1):103-104.

(收稿日期:2014-03-26)

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图1 马鞍山区域标本的PCR产品电泳图

2.2 同源性剖析

将33份纯化后的阳性标本的核苷酸序列与EV71病毒各基因型和亚型代表株的相应片段进行同源性比较(表1)。33株EV71病毒别离株与 CA16、A、B 基因型及亚型代表株的同源性差异较大,与CA16代表株核苷酸同源性仅为49.2%~53.4%,与C代表株同源性差异较小,为82.6%~98.6%。与 B基因型及其亚型代表株的同源性为78.1%~81.4%,与A代表株(U22521)的同源性为75.0%~79.3%;与C4基因亚型同源性最高,达92.1%~98.6%。马鞍山12株内部同源性最高,到达99.5%~100%,南京11株内部同源性为96.5%~100%,而芜湖10株同源性为96.3%~100%。三城市之间毒株比较发现,马鞍山与南京毒株间的同源性在92.5%~94.7%之间;马鞍山与芜湖毒株间的同源性较高,为96.3%~100%;而南京、芜湖毒株间的同源性最低,仅为89.8%~94.1%。

2.3基因分型

从基因进化树(图2)能够看到,CA16 U05876毒株单独成一分支,EV71 A型U22521株构成一个首要分支;AF376066、AF376117、U22522、AY905548、AY135873株则别离构成B1~B5亚型;33例阳性标本与来源于新加坡、台湾及阜阳的6个毒株构成一个分支,该分支较大。上述成果提示,33份标本归于C型EV71病毒,一起和阜阳EU703812毒株构成同一亚型,为EV71 C4b病毒。C型EV71分支中可持续分为5个亚型。其间AF135948 和AB552988一起构成一个亚型,为亚型C2。AF135932单独构成一个亚型,为亚型C1;阜阳株和咱们的研讨中发现的33株组成一个分支,为亚型C4。

3 评论

1969年EV71病毒初次从一名患有中枢神经系统疾病的婴儿中别离出。尔后全球范围内均有EV71病毒的相关盛行报导。曩昔40多年间,共三次全球大盛行。其间,我国台湾区域于1998年发作了HFMD的大盛行,共呈现病例为129 106例,其间严峻病例405例,逝世78例,大部分死由于肺水肿和肺出血,其间<5岁的逝世患儿占91%,其间48.7%的患者感染EV71[2]。

由于HFMD首要由EV71 和 CVA16 引起,但两者临床症状相似,难以区别,因而首要依托试验室确诊。现在试验室惯例确诊办法首要有免疫组化、病毒别离及中和抗体水平的检测。但是,这些办法需较大人力、物力及时刻,无法满意快速确诊和大样本的显现需求。研讨标明[9]肠道病毒(EV)的血清型与VP1基因序列密切相关,可用于判定 EV血清型;一起由于其存在最大的变异率,因而研讨人员使用这一点对EV病毒进行相关的分子盛行病学研讨。

本研讨以EV71病毒特异性片段为引物,扩增出 EV71 VP1区232bp的基因片段,然后到达快速确诊意图。本研讨对143份咽拭子标本进行了扩增,其间33份标本的PCR成果为阳性。一起,课题组对33株EV71病毒的特异性序列进行了相关的基因进化剖析。试验成果标明33株病毒与 A型及B型代表株存在较大差异,而与 C型代表株存在较高的同源性,特别与归于C4亚型毒株有很高同源性。

以往研讨以为各毒株基因型内部的差异>15%视

为一个新的基因型,而同源性<12%为亚型分型的规范[9]。试验中所别离的33株EV7病毒与C型病毒有82.6%~98.6%的同源性序列。因而依据上述规范,应该呈现新的病毒型或病毒亚型。但是从基因树的成果进行剖析,33株病毒仍旧为C型病毒。构成该现象发作的可能原由于:PCR扩增的序列片段较小,构成有较大差异的同源性现象的构成。当时国内对EV71的检测研讨所扩增的序列均为200~350 bp。因而,持续以之前的分型规范进行病毒分型值得商讨。

依据基因同源性的成果,咱们发现33株EV71别离株尽管均归于C4亚型,但不同城市所别离的毒株同源性并不高,存在较大变异。因而,对EV71分子盛行病学进行深化的研讨有利于咱们研发特异性强、灵敏度高的确诊试剂和EV71疫苗。

[参考文献]

[1]周晓凤,熊林. 重症手足口病并发脑炎患儿的护理干涉[J]. 我国现代医师, 2013,51(15):98-99.

[2]Ho M,Chen ER,Hsu KH,et al. An epidemic of enterovirus 71 infection in Taiwan[J]. N Engl J Med,1999,341(13):929-935.

[3]仇桂华,何燕平,刘艺颍,等. 重症手足口病(EV71感染)并发神经源性肺水肿患儿的急救与护理[J]. 安徽医学,2008,29(4):367-368.

[4]姜青松. 郑州市二七区2009年手足口病盛行病学剖析[J]. 我国现代医师,2011,49 (8):113-114.

[5]Brown BA,Oberste MS,Alexander JP,et a1. Molecular epi- demiology and evolution of entero- virus 71 strains isolated from 1970 to 1998 [J]. Virol,1999,73(12):9969-9975.

[6]王美芬,陈韬杜,曾庆,等. 2010年昆明及周边区域普通型与重型手足口病病原学剖析[J]. 我国有用医刊,2013, 40(1):30-32.

[7]崔爱利,许文波,李秀珠,等. 肠道病毒71型的RT-PCR确诊及基因特征[J]. 病毒学报, 2004,20(2):160-165.

[8]陈国兵,孟继鸿. 戊型肝炎病毒摩洛哥株非编码区基因序列判定及基因型分型[J]. 中华微生物学和免疫学杂志,2004,24(10):828-833.

[9]张颖,和鹏,陈纯,等. 广州市2011年柯萨奇病毒A组6型的分子盛行病学特征[J]. 中华盛行病学杂志,2014, 35(1):103-104.

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