陈彦杰+褚银玲+韩超轶+张洁
[摘要]意图 树立HPLC办法测定魔芋精粉中葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）含量，并对高效液相色谱（HPLC）法与比色法测定成果进行比较。办法 魔芋葡甘聚糖用2.5 mol/L的H2SO4溶液110℃水解2 h，生成D-甘露糖、D-葡萄糖，经与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）反响得到衍生物。HPLC法中选用的色谱柱为TOSOH TSK-GEL ODS，活动相A（乙腈）∶活动相B（0.45 g磷酸二氢钾、0.5 ml TEA、100 ml乙腈、900 ml纯水混合，pH=7.5）进行梯度洗脱，流速为1.0 ml/min，检测波长250 nm，柱温30℃；比色法参照GB/T 18104-2000进行测验。成果 HPLC法测定中D-甘露糖和D-葡萄糖别离在21.2～159.3 μg（r=0.9998）和21.5～154.2 μg（r=0.9999）规模内线性关系杰出；KGM均匀回收率为98.9%，RSD为2.2%。与比色法比含量少5%～7%。定论 HPLC法与比色法比较测定KGM含量更精确，可更好地用于魔芋精粉质量操控和分级。
[要害词]魔芋；葡甘聚糖；比色法；高效液相色譜法；含量测定
[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）12（c）-0125-04
Determinination of konjac glucomannan in konjac refined powder by HPLC
CHEN Yan-jie CHU Yin-ling HAN Chao-yi ZHANG Jie
ENNOVA Health Science and Technology Co.，Ltd. of ENN Group，Langfang 065001，China
[Abstract]Objective To establish an HPLC method for content determination of konjac glucomannan （KGM） in konjac refined powder，and compare with results of colorimetric assay.Methods KGM was hydrolyzed with H2SO4 （2.5 mol/L） at 110℃ for 2 hours，which reacted with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone （PMP） before HPLC separation and formed two monosaccharides，D-mannose and D-glucose.HPLC was performed on the column of TOSOH TSK-GEL ODS with gradient elution of mobile phase A （acetonitrile） and mobile phase B （0.45 g potassium dihydrogen phosphate，0.5 ml TEA，100 ml acetonitrile，900 ml water，pH=7.5）.The flow rate was 1.0 ml/min，detection wavelength was 250 nm，and column temperature was 30℃.Colorimetric method was tested with reference to GB/T18104-2000.Results Linearity of D-mannose was good in range of 21.2-159.3 μg （r=0.9998）；while D-glucose in range of 21.5-154.2 μg （r=0.9999）.The average recovery of KGM was 98.9% （RSD 2.2%）.The contents were less 5%-7% than that by colorimetry.Conclusion HPLC method is more accurate than colorimetry to determine content of KGM in konjac refined powder，and would be better for quality control and grading of konjac refined powder.
[Key words]Konjac；Glucomannan；Colorimetry；HPLC；Content determination
魔芋精粉是从多年生草本植物魔芋（Amorphophallus rerieri）块根中经枯燥、破坏、风选等进程后取得。从养分学视点看，魔芋精粉是一种低热、低脂、低糖和高膳食纤维的食物。跟着研讨的深化，人们对膳食纤维的知道逐步从“无养分物质”到今日具有重要的生理效果[1-2]，并被养分学界认定为第7类养分素。研讨标明富含膳食纤维的魔芋精粉具有降血脂、降血糖、通便和维护肝脏等效果[3-6]。
魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）是魔芋精粉首要成效成分，也是点评魔芋精粉和相关产品质量的要害目标[7-8]，其间GB/T 18104-2000中就是依据KGM的含量对魔芋精粉进行分级。KGM归于可溶性半纤维素，结构包含由D-葡萄糖和D-甘露糖经过β-1，4糖苷键聚合而成的主链，以及在主链甘露糖上由β-1，3糖苷键聚合的支链[9]。KGM具有亲水性、增稠性、稳定性好和口感滑润细腻等多种特征，一起又具有多种保健功用，广泛使用于一般食物、保健食物乃至药品中[10-12]。KGM含量测定办法包含比色法[7]、气相色谱法[8]和高效液相色谱（HPLC）法[13-15]等。HPLC法中有选用糖剖析柱或许氨基柱结合示差检测器测定含量，不需要衍生的进程，可是对色谱柱和检测器要求较高；也有选用PMP衍生化后用C18色谱柱结合紫外检测器测定含量。本试验经过优化PMP衍生条件树立反相高效液相色谱测定魔芋精粉中KGM的含量；一起参照GB/T18104-2000用比色法测定魔芋精粉中KGM含量，剖析比较两种测定办法的优缺点。
1 仪器与资料
1.1仪器和设备
Agilent 1100高效液相色谱仪装备二级管阵列（DAD）检测器，美国安捷伦公司；UV-2102紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；十万分之一剖析天平，瑞士Mettler-Toledo公司；L420离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司。
1.2药品与试剂
魔芋精粉从陕西秦东魔芋食物有限公司（样本1）、宣城市百草植物工贸有限公司（样本2）、陕西龙飞魔芋食物有限公司（样本3）和武汉市清江魔芋制品有限公司（样本4～9）。D-甘露糖和D-葡萄糖均购自于我国食物药品检定研讨院（批号别离为140651-201403；110833-201205）；L-鼠李糖，北京化学试剂公司；乙腈为色谱纯，水为超纯水。除非还有阐明，在剖析中所用试剂均为剖析纯试剂。
2办法与成果
2.1色谱条件
色谱柱：TOSOH TSK-GEL ODS色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），活动相A（乙腈）∶活动相B（0.45 g磷酸二氢钾、0.5 ml TEA、100 ml乙腈、900 ml纯水混合，pH=7.5）进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为0.0～4.0 min 94% B，4.0～5.0 min 94%～88% B，5.0～30.0 min 88% B，流速1.0 ml/min，柱温30℃，检测波长250 nm；进样量5 μl，按上述色谱条件，测定成果见图1～3。
2.2溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 别离精细称取D-甘露糖和D-葡萄糖对照品适量，置于2 ml量瓶中，用高纯水溶解，制成浓度别离为0.56 mg/ml和0.60 mg/ml混合对照品溶液。精细汲取混合对照品溶液20、50、100、120、150 μl于5支5 ml具塞玻璃试管中，参加内标50 μl L-鼠李糖（1.08 mg/ml）储藏液，依照“2.2.2”项下供试品溶液的制备④进行衍生化，即得。
2.2.2供试品溶液的制备 ①魔芋精粉中游离还原糖的别离：精细称取魔芋精粉0.12～0.15 g至150 ml烧杯中。参加85%乙醇50 ml，在50 ℃恒温水浴中保温30 min并不断拌和，取出、静置、吸出上清液。再用85%乙醇提取两次，别离出溶于乙醇中的游离还原糖，当心搜集悉数去除了游离还原糖的魔芋精粉，蒸去乙醇，备用。②魔芋葡甘聚糖提取液的制备：将已处理的魔芋精粉，加高纯水60 ml，室温下拌和1～2 h溶胀过夜。然后用高速匀浆机匀浆40 s，注入100 ml容量瓶中，用高纯水屡次洗尽匀浆机回头和烧杯，洗液移入100 ml容量瓶中，用高纯水定容。以4000 r/min转速离心20 min，取上清液即得。③水解：汲取上述溶液100 μl，参加70 μl （2.5 mol/L H2SO4），110℃烘箱中水解2 h，取出冷却后，用70 μl（5 mol/L NaOH），涡旋混匀中和，参加内标50 μl L-鼠李糖（1.08 mg/ml），室温减压枯燥。④衍生化：上述水解液再加200 μl PMP甲醇溶液（0.5 mol/L）与100 μl NaOH溶液（0.3 mol/L），渦旋混匀；在70℃恒温水浴中反响60 min，取出放置10 min冷却至室温；参加100 μl HCl （0.3 mol/L）中和，参加纯水1 ml；再加氯仿2 ml，重复萃取三次，水相经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试液。
2.3 检测限和定量限
以信噪比为3∶1时的色谱峰为检出限，以信噪比为10∶1的色谱峰为定量限。成果D-甘露糖的检测限和定量限别离为1.032、1.543 nmol；D-葡萄糖的检测限和定量限别离为2.537、3.319 nmol。
2.4 线性关系调查
别离精细汲取“2.2.1”项下所得不同浓度对照品溶液，依照“2.1”项下的色谱条件剖析，以对照品的峰面积与内标峰面积之比为纵坐标（y），以对照品的量（nmol）为横坐标（x），进行线性回归，得D-甘露糖的回归方程为y=1.1470x+0.0088（0.9998），D-葡萄糖的回归方程为y=0.9726x+0.0036（0.9999）。成果标明，D-甘露糖和D-葡萄糖的检测线性规模别离为1.179～8.842 nmol、1.141～8.559 nmol。
2.5 精细度试验
取同一份魔芋精粉按“2.2.2”项下的进程操作，所得供试液依照“2.1”项下的色谱条件接连进样6次，记载峰面积，核算出含量。成果，D-甘露糖和D-葡萄糖含量的RSD别离为0.77%、0.18%，标明仪器精细度杰出。
2.6稳定性试验
取同一份魔芋精粉按“2.2.2”项下的进程操作，所得供试液别离于放置0、2、4、6、8、12、24 h依照“2.1”项下的色谱条件进样测验，依据测得D-甘露糖、D-葡萄糖质量，核算KGM含量，其均匀值为79.41%，RSD为0.22%，标明供试品液在24 h内稳定性杰出。
2.7重复性试验
取同一份魔芋精粉按“2.2.2”项下的进程操作，平行制备6份供试品溶液，依照“2.1”项下色谱条件进样，依据测得D-甘露糖、D-葡萄糖质量，核算KGM含量RSD为1.48%，标明本办法重复性杰出。
2.8加样回收率试验
供试品溶液制备中①和②步彻底依照GB/T18104-2000操作，因而，本试验中笔者只调查酸水解和衍生进程中的加样回收率。精细汲取供试品溶液制备中②步取得的KGM提取液50 μl共6份，别离参加50 μl已知浓度的KGM对照品溶液。依照“2.2.2”项下供试品溶液制备的③和④进程操作，所得供试液依照“2.1”项下中色谱条件进样，核算KGM加样回收率，测得的成果见表1。
2.9样品含量测定
依据树立的办法用HPLC-UV的办法对购买于不同厂家9份魔芋精粉中KGM含量进行测定。一起，严厉依照GB/T18104-2000的要求使用比色法测定魔芋精粉中KGM含量。两种办法的测定成果见表2。
3评论
供试品制备进程中，发现衍生进程中参加PMP[16-17]和NaOH的量很要害，经过探索断定本试验中的量为最佳。酸水解时刻和温度参照文献办法都能水解彻底[7，18-19]。
与比色法比较，HPLC办法的供试品制备进程稍杂乱，时刻稍长。可是从试验成果上看，HPLC法测定值均比比色法小5%～7%。KGM分子中只含有葡萄糖和甘露糖， HPLC法是针对水解产品中葡萄糖和甘露糖进行含量测定；而比色规律针对水解产品中所有还原糖进行测定。由此估测本试验断定的HPLC法测定魔芋质料中葡甘聚糖的含量与GB/T18104-2000选用比色法测定的含量比较可能愈加精确，可以更有效地操控魔芋精粉的质量和进行魔芋精粉的分级。
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