高淑慧 瞿创 吴凤麟 沈晗
[摘要]意图 针对人源的CCL17和CCL22基因进行CRISPR/Cas9-gRNA规划，并验证规划的sgRNA的有用敲除功率。办法 使用CRISPR网站供给的东西对CCL17和CCL22基因的靶向修改位点进行挑选规划，然后构建CRISPR-Cas9-CCL17和CRISPR-Cas9-CCL22敲除质粒，并将构建好的质粒转入293 T细胞系，然后经过基因组PCR产品的T-A克隆测序办法别离验证规划的sgRNA敲除质粒的修改功率。成果 成功构建针对于人源CCL17和CCL22基因的sgRNA敲除质粒，并有着杰出的修改功率，均达70%以上。定论 针对CCL17和CCL22基因规划的CRISPR敲除质粒对靶基因有着很好的修改作用，为后续依据CCL17和CCL22的相关性研讨奠定了根底。
[关键词]CRISPR；引导RNA；趋化因子；基因修改
[中图分类号] R319 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）4（c）-0004-05
Study on genome editing targeting CCL17 and CCL22 using CRISPR-Cas9 system
GAO Shu-hui QU Chuang WU Feng-lin SHEN Han▲
School of Biosciences and Biopharmaceutics，Guangdong Pharmaceutical University，Guangdong Province Key Laboratory for Biotechnology Drug Candidate，Guangzhou 510006，China
[Abstract]Objective To design CRISPR/Cas9-gRNA targeting human CCL17 and CCL22 gene，and to evaluate the editing effectiveness of the sgRNA.Methods The targeted editing sites of CCL17 and CCL22 genes were screened using tools provided by CRISPR website，then the knockout plasmid of CRISPR-Cas9-CCL17 and CRISPR-Cas9-CCL22 were constructed and separately transfected into 293 T cells.Finally，the T-A editing and sequencing methods of genomic PCR products were used to verify the editing efficiency of the designed sgRNA knockout plasmid.Results The knockout plasmid of CRISPR-sgRNA targeting human CCL17 and CCL22 gene was successfully constructed with high editing efficiency，reached more than 70%.Conclusion The CRISPR-Cas9-CCL17 and CRISPR-Cas9-CCL22 show good editing efficiency，which provide foundation for the deep research of the function on CCL17 and CCL22.
[Key words]Clustered regularly interspaced short palindromic reapeat；sgRNA；Chemokines；Genome editing
趋化因子是一组具有趋化作用的小分子蛋白，参加机体各种免疫细胞的搬迁，并在部分免疫调理的各种安排中承当重要功用。现在，已有许多研讨标明机体免疫体系与肿瘤的发作、开展相互作用，而趋化因子因对免疫细胞的搬迁作用成为肿瘤研讨中新的关注点[1]。CCL17，即胸腺和活化调理趋化因子（thymus and activation regulated che-mokine，TARC），與CCL22，即巨噬细胞来历的趋化因子（macrophage-derived che mokine，MDC）同为趋化因子大家族中的一员，人源基因均定坐落染色体16q13，两者有37%同源氨基酸序列[2-5]，且共有一个高亲和力受体CCR4，是CC趋化因子受体（CC chemokine receptor，CCR），由Power等在嗜碱性粒细胞系中得到，具有蛋白激酶作用的磷酸化位点，广泛表达于单核细胞、树突状细胞、中性粒细胞、NK细胞和T细胞等炎症相关细胞[6-7]。开端的研讨发现，CCL17和CCL22参加过敏性炎症反响的发作、开展。一方面Semmling等[8]发现，在α-GC诱导的穿插免疫反响中，CD8+ DC细胞在穿插提呈进程中排泄的趋化因子CCL17不仅能促进NKT细胞表达趋化因子受体CCR4并与其结合后影响NKT细胞的活化，还能促进DC细胞与初始T细胞的触摸然后进步提呈功率，以发挥免疫监视作用。Naoko等[9]又发现，经瘤内打针AdRGD-CCL17显着减缓了CT26肿瘤模型的疾病开展，且肿瘤衰退首要与免疫效应细胞在肿瘤安排部位滋润相关。另一方面，在肿瘤免疫逃逸进程中发挥重要作用的Tregs细胞可以有用按捺效应T细胞的抗肿瘤作用，而Treg细胞外表表达CCR4受体，在Gobert等[10-13]的研讨中，Treg细胞在肿瘤微环境中的搬迁则首要经过趋化因子CCL22介导。
作为CCR4的高亲和力受体，趋化因子CCL17和CCL22尽管在许多方面有相似性，但其在免疫体系中的调理作用却各有不同，因趋化因子首要是经过与其受体结合而发挥作用，而许多研讨都是将CCR4基因缄默沉静，一起按捺了CCL17和CCL22的功用，笔者别离针对人源CCL17和CCL22基因规划靶向CRISPR-sgRNA敲除质粒，然后能更好地对趋化因子各自的功用进行更完全的相关性研讨[14]。
CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic reapeat/CRISPR-associated nuclease 9）体系是一种继锌指核酸酶之后的可对基因组进行靶向润饰的新式修改技能，其开发具有本钱低、易于构建、修改功率高级优势，在研讨中的使用更为广泛[15-17]。本试验选用CRISPR/Cas9体系对人源性趋化因子CCL17和CCL22基因进行了基因修改方面的探索性研讨，旨在为后续趋化因子CCL17和CCL22的相关研讨奠定根底。
1资料和办法
1.1资料
pX458质粒为试验室保存菌种；大肠埃希菌DH5α感受态购自广州TAKARA署理公司；pGEM-T Easy Vector与T4DNA衔接酶购自Promega公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit与PCR Cleanup Kit试剂盒购自AXYGEN公司；BbsⅠ限制性内切酶与DNA聚合酶购自广州NEB署理公司；引物与sgRNA均由英潍捷基公司组成。
1.2靶向sgRNA的规划及寡核苷酸链组成
经过NCBI网站得到意图基因CCL17和CCL22的基因序列，然后归纳多个规划sgRNA的网站挑选成果与PAM位点准则取得20个碱基，一起在正向5′端加碱基序列”cacc”，反向5′端加碱基序列”aaac”，使sgRNA的黏性结尾能与BbsⅠ酶切后的黏性结尾互补（表1）。
表1 CCL17、CCL22gRNA中心序列
1.3 pX458-sgRNA质粒载体的构建
将公司组成的sgRNA序列稀释至必定浓度，然后进行磷酸化润饰，产品置于4℃保存。使用限制性内切酶BbsⅠ将pX458质粒进行酶切，酶切产品进行切胶收回后与载体进行4℃过夜衔接，衔接产品转入大肠埃希菌感受态DH5α，培育后挑选阳性单克隆菌落摇菌后取部分菌液送去测序。
1.4 pX458质粒功用的验证
1.4.1细胞转染 取成长状况杰出的293 T细胞经消化处理成单细胞悬液后进行计数，以每孔5×106个细胞种于六孔板中，待8～10 h细胞贴壁后密度到达80%，磷酸钙转染法将前期构建成功的pX458-CCL17和pX458-CCL22敲除质粒别离转染293 T细胞。24 h后可经过荧光倒置显微镜来调查绿色荧光蛋白的表达状况，72 h后可凭借流式细胞仪来检测转染功率。
1.4.2细胞基因组DNA的提取和PCR扩增 使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit试剂盒提取72 h后293 T细胞的基因组DNA。针对靶向基因CCL17和CCL22挑选的sgRNA位点，在位点300～500 bp邻近规划一对引物（CCL17 Knockout-F：5′-AGATCTTCCACGAACACCCC-3′；CCL17Knockout-R：5′-AATAGGTTGGACCTCATGGC-3′；CCL22 Knockout-F：5′-CCCCGCTCCTAGAGCTGACT-3′；CCL22 Knockout-R：5′-TCTGGTAGCCCTGCCACATT-3′）进行修改后基因组DNA扩增，将扩增好且条带正确的PCR产品送去公司测序。
1.4.3 PCR产品纯化、T载体衔接及测序 对PCR测序成果进行剖析，挑选有套峰呈现的PCR产品经AxyPrep PCR Cleanup Kit试剂盒纯化后测定产品浓度，然后与pGEM-T载体4℃过夜衔接，将衔接好的产品转入大肠埃希菌DH5α感受态，37℃培育12～16 h，然后挑取阳性单克隆菌落摇菌并进行菌液PCR测序，将测序成果进行相应的剖析核算。
2成果
2.1 pX458-sgRNA质粒载体的构建剖析
衔接产品转化大肠埃希菌挑取单菌落后用U6、sgRNA反向序列作上下游引物经PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，将呈现意图条带的菌液进行测序，用软件剖析测序后碱基序列，如图1所示，即阳性菌落测出的碱基序列与规划的sgRNA序列完全相同，确定在酶切位点成功刺进sgRNA，由此，靶向CCL17和CCL22基因的敲除质粒构建成功。
图1 所构建pX458质粒的测序成果
2.2 pX458質粒的细胞转染功率剖析
处理转染时刻达72 h的细胞，以未转染质粒组作空白对照，经过流式细胞仪检测敲除质粒转染组的绿色荧光蛋白的表达状况然后核算转染功率，成果如图2所示。
Control：未转pX458敲除质粒的阴性组；CCL17、CCL22：相应pX458敲除质粒转染组
图2 PX458质粒转染功率的检测成果
2.3 pX458质粒转染后修改功用的检测
别离将转染pX458-CCL17与pX458-CCL22质粒的各细胞组经消化处理后提取293 T细胞基因组的DNA，依据规划好的PCR产品进行扩增，然后测序剖析，发现阴性未转染组在PAM位点根本都是单一的峰，而pX458-CCL17与pX458-CCL22质粒转染组在PAM位点前3个碱基处开端呈现显着的套峰（如图3A），提示规划的sgRNA均有杰出的靶向性。T-A克隆后，将呈现条带的菌液送测序后剖析测序成果，靶向CCL17基因的10个测序样品中有9个克隆呈现修改状况，如图3B所示，有2个克隆在同一位点发作9个碱基的缺失，其他7个则是在不同位点发作缺失状况，且碱基的缺失数目也不同，由此得出pX458-CCL17敲除质粒的修改功率为90%。靶向CCL22基因共有6个克隆呈现了修改状况，如图4B所示，有1个克隆呈现1个A/T碱基的刺进，其他5个则是不同碱基数意图缺失，共送样20个阳性克隆测序，考虑到其转染功率，由此得出pX458-CCL22敲除质粒的修改功率为73.2%。
A.基因组PCR测序成果；B.基因组PCR的T-A克隆测序成果
“-”表明碱基序列的丢掉，“+”表明碱基序列的刺进，“*”表明该修改序列在测序中重复呈现的次数
图3 CCL17-sgRNA的修改功率成果
A.基因组PCR测序成果；B.基因组PCR的T-A克隆测序成果
“-”表明碱基序列的丢掉，“+”表明碱基序列的刺进，“*”表明该修改序列在测序中重复呈现的次数
图4 CCL22-sgRNA的修改功率成果
3评论
跟着肿瘤免疫研讨的开展，机体免疫体系在肿瘤的发作、發展及转归方面的相关作用机制逐步成为热门，趋化因子可以趋化各种免疫细胞的搬迁，因而在机体免疫调理中承当侧重要功用。越来越多的研讨发现，趋化因子参加肿瘤微环境的调理，影响肿瘤开展。Henry等[18-19]的研讨发现，DC细胞可以排泄趋化因子CCL17促进与初始T细胞的活化作用，增强抗肿瘤免疫作用。又有报导闪现，在卵巢癌中趋化因子CCL22可以经过与CCR4结合趋化Treg细胞的搬迁然后按捺杀伤性T细胞的抗肿瘤作用[20]。虽CCL17与CCL22有一起的高亲和力受体CCR4，但两者在肿瘤免疫中的作用机制仍备受争议[21-22]。因为以往研讨大多是将CCR4受体按捺后再进行相关研讨，然后无法直接对CCL17和CCL22各自的功用进行研讨，所以本文结合日渐老练的CRISPR/Cas9修改技能，别离针对CCL17和CCL22基因规划靶向sgRNA，然后可认为CCL17和CCL22两者更谨慎的研讨供给东西，奠定根底。
CRISPR/Cas9靶向基因修改体系是继锌指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）[23]和转录激活因子样效应物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）[24]之后的新式定点修改技能，但后两者的挑选和拼装进程都需求较高的技能要求，而且潜在的细胞毒性问题也需求后续研讨，而CRISPR/Cas9修改体系则具有本钱高、易于构建及修改功率高级优势，其开发为基因定点润饰技能供给了新的渠道，越来越成为研讨的热门[25]。
本研讨则使用CRISPR/Cas9修改体系对趋化因子CCL17和CCL22进行定点修改，在构建载体时选用pX458质粒，质粒上带有BbsⅠ酶切位点，在规划的sgRNA上增加黏性结尾则可连入pX458质粒，操作简略。依据前期对sgRNA的PAM结构的相关规划准则研讨，选取修改功率最好的NGG（N可认为A/T/C/G）结构5′端的20个碱基作为靶向序列，并联合多个规划网站归纳评分规划出sgRNA-CCL17和sgRNA-CCL22。成功构建pX458-CCL22和pX458-CCL22敲除质粒后，在修改功率的验证进程中，因为同一基因在同一种属的不同细胞中的基因组序列是相同的，因而选取惯例的磷酸钙转染293 T细胞来验证敲除功率。因转染功率未到达预期作用，使用pX458本身带有的绿色荧光陈述蛋白将细胞进行流式分选，将转染成功的细胞分选后再进行基因组的提取及后续研讨，经过修改后的测序剖析，发现经过将细胞分选后再进行基因组的提取及后续PCR产品扩增，修改状况及修改功率则能更完全地闪现。测序成果闪现，尽管针对两个基因在规划sgRNA时遵从的规划准则相同，但在实践的修改中功率仍会呈现差异，剖析原因应与基因本身的sgRNA有关，因而在规划sgRNA时应归纳考虑，尽量遵从已报导的具有高修改功率的序列特色。此外，与杰出的修改功率比较，往后的试验还应考虑到基因修改的脱靶率的相关研讨。
综上所述，本研讨成功构建别离针对于人源CCL17和CCL22基因的CRISPR/Cas9敲除质粒，并经过验证，规划的sgRNA序列具有较好的修改功率，为趋化因子CCL17和CCL22在肿瘤免疫中后续的研讨供给了东西，奠定了根底。
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（收稿日期：2018-01-30 本文編辑：祁海文）
