王露+孙怡+李惠+王剑蓉
[摘要] 意图 评论乳腺癌白腊肿瘤安排和相应血液细胞中乳腺癌易感基因1（BRCA1）与切除修正穿插互补基因1（ERCC1）及胸苷酸组成酶（TS）基因表达的相关性，一起评论BRCA1、ERCC1、TS在乳腺癌肿瘤安排与对应患者血液细胞中表达的联系。 办法 搜集53例乳腺癌肿瘤白腊标本及其对应的血液样本，运用实时荧光定量PCR技能检测肿瘤白腊安排和对应血液样本中BRCA1、ERCC1 、TS mRNA的表达水平；运用Pearson相关性剖析办法剖析肿瘤白腊安排和相应血液细胞BRCA1、ERCC1、TS mRNA表达的相关性以及肿瘤白腊安排细胞BRCA1、ERCC1、TS mRNA之间表达的相关性。 成果 乳腺癌白腊安排中BRCA1 mRNA 表达的ΔCT为（7.516±2.257），对应的血液安排中为（10.374±2.519）。乳腺癌白腊安排中ERCC1和TS mRNA表达的ΔCT别离为（6.114±2.944）、（5.950±2.604），对应的血液安排别离为（8.801±2.581）、（10.078±1.731）。Pearson相关性剖析显现，BRCA1、ERCC1在肿瘤白腊安排与血液安排中的表达均呈正相关（r=0.607、0.537，P<0.05）。肿瘤白腊安排与血液安排中的TS表达无相关性（r=0.074，P>0.05）。BRCA1与ERCC1在肿瘤白腊安排中的表达无相关性（r=0.250，P>0.05）。BRCA1与TS在肿瘤白腊安排中的表达无相关性（r=0.256，P>0.05）。ERCC1与TS在肿瘤白腊安排中的表达无相关性（r=0.169，P>0.05）。 定论 乳腺癌患者的血液标本或许能够代替其肿瘤白腊安排检测BRCA1和ERCC1 mRNA的表达；BRCA1与ERCC1、TS的表达无相关性。
[要害词] 乳腺癌；乳腺癌易感基因1；切除修正穿插互补基因1；胸苷酸组成酶基因
[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）09（c）-0007-05
The research on the correlation of BRCA1，ERCC1，TS mRNA expression in the paraffin tumor tissue and corresponding blood cells for breast cancer
WANG Lu SUN Yi LI Hui WANG Jian-rong▲
Department of Pathology，TCM Hospital of Jiangsu Province，Nanjing 210000，China
[Abstract] Objective To investigate the correlation between the expression of breast cancer gene 1 （BRCA1），excision repair cross-complementing gene 1（ERCC1） and thymidylate synthetase （TS） gene in paraffin tumor tissue and corresponding blood cells for breast cancer. Methods Tumor paraffin specimens and their corresponding blood samples in 53 cases were collected，the expression level of BRCA1，ERCC1，TSmRNA of tumor paraffin samples and corresponding blood samples were detected by real-time fluorescence quantitative PCR technology，Pearson correlation analysis method was used to analyze the correlation of BRCA1，ERCC1，TS mRNA expression of tumor paraffin tissue and the corresponding blood cells and the correlation of the expression between BRCA1，ERCC1，TS mRNA in the tumor paraffin tissue cells. Results In the breast cancer paraffin tissues，the ΔCT of BRCA1 mRNA expression was （7.516±2.257），while in the corresponding blood tissue，the ΔCT was （10.374±2.519）.In the breast cancer paraffin tissue，the ΔCT of ERCC1 and TS mRNA expression was （6.114±2.944），（5.950±2.604） respectively，while in the corresponding blood tissue，the ΔCT was （8.801±2.581），（10.078±1.731） respectively.Pearson correlation analysis showed that there was positive correlation between the expression of BRCA1，ERCC1 in tumor paraffin tissue and blood tissue （r=0.607，0.537，P<0.05）.There was no correlation between the expression of TS in tumor paraffin tissue and blood tissue （r=0.074，P>0.05）.There was no correlation between BRCA1 and ERCC1，BRCA1 and TS，ERCC1 and TS mRNA expression in tumor tissue （r=0.250，r=0.256，r=0.169，P>0.05）. Conclusion Blood samples of patients with breast cancer may be able to replace tumor paraffin tissue to detect the BRCA1 and ERCC1 mRNA expression.There was no correlation between the expression of BRCA1 and ERCC1，TS in breast tumor tissue.
[Key words] Breast cancer；Breast cancer gene 1；Excision repair cross-complementing gene 1； Thymidylate synthetase gene
乳腺癌是女人常见肿瘤之一，占女人全身恶性肿瘤的7%～10%，有年轻化趋势[1]。临床上以彻底治愈性切除为乳腺癌的首要医治办法，术后常需辅佐化疗。2010 年NCCN “乳腺癌临床实践攻略”提出关于Ⅱ、Ⅲ期乳腺癌患者可给予术前新辅佐化疗[2]。2010年NCCN提示，紫杉醇类是乳腺癌化疗中的首要化疗药物之一，紫杉醇类联合卡铂、氟尿嘧啶或卡培他滨等化疗药物活跃运用于乳腺癌的化疗[2]。乳腺癌易感基因1（BRCA1）是一种多功能按捺蛋白，是第一个被发现的乳腺癌抑癌基因。1994 年作为乳腺癌和卵巢癌的易感基因此被提出来[3-4]。BRCA1 在调理细胞对紫杉类药物的灵敏性方面起着非常重要的效果[5-8]。BRCA1 低表达的细胞株对紫杉醇类药物表现为耐药；高表达示紫杉醇类化疗药物有活跃效果[9-11]。切除修正穿插互补基因1（ERCC1）是细胞内DNA 损害、核苷酸剪切修正系统（NER）通路中的要害基因，对癌细胞效果和机体细胞损害修正的差异性有重要含义。临床研讨证明，ERCC1 基因与铂类化效果果相关[12-13]，低表达者铂类药物化疗的效果好、毒副反响小及生计期长[14]。胸苷酸组成酶（TS）基因是组成胸苷酸的限速酶，是一种叶酸依赖性酶，催化2′-脱氧尿苷-5′-磷酸（dUMP）转化为2′-脱氧核苷-5′-磷酸（dTMP），一起也是氟尿嘧啶的靶酶[15]。NCCN医治标准提示，TS-mRNA低水平表达运用氟尿嘧啶、卡培他滨、培美曲赛等药物化疗有活跃效果[16-17]。化疗相关分子检测有助于乳腺癌患者的个体化医治，有助于进步化效果果和降低毒副反响。BRCA1、ERCC1、TS基因表达的检测有助于紫杉醇类、铂类、氟尿嘧啶等化疗药物的合理运用，以进步乳腺癌患者的化效果果，削减药物毒副效果。
本研讨搜集了52例乳腺癌患者的肿瘤白腊安排和相对应的血液细胞，运用SYBR Green 荧光实时定量PCR（RT-qPCR）技能，定量剖析BRCA1、ERCC1、TS mRNA在肿瘤白腊安排及其对应血液安排的表达水平，剖析BRCA1别离与ERCC1、TS表达的相关性，评论乳腺癌化疗药物紫杉醇联合卡铂、氟尿嘧啶等化疗药物的相关基因BRCA1、ERCC1、TS mRNA表达的联系以及是否能用血液安排代替肿瘤安排进行相关基因检测。
1 材料与办法
1.1 试验材料
搜集2008年3月～2013年10月南京中医药大学隶属江苏省中医院病理科及外院送检的53例乳腺癌肿瘤白腊标本及对应患者的血液标本。年纪29～75岁，均匀49.788岁。一切肿瘤白腊标本均经惯例病理HE染色后由病理科医生确诊。
1.2 仪器及试剂
白腊安排RNA提取试剂盒（RNase-free FFPE kit） 购自德国Qiagen 公司，血液标本RNA 提取试剂盒（blood RNA kit）购自美国Omega公司，核酸蛋白测定仪购自美国Eppendorf Bio公司，逆转录反响试剂盒购自美国Promega公司，SYBR Green购自美国Lifetech 公司，7900 定量PCR仪购自美国ABI 公司；BRCA1、ERCC1、TS 和β-actin mRNA表达相关引物由上海生工生物工程技能服务有限公司组成。
1.3 办法
1.3.1 总RNA提取 肿瘤白腊安排：依据病理医生镜下HE染色切片确诊，挑选最佳肿瘤白腊蜡块，切取10 μm厚白腊白片10 张，经二甲苯脱蜡，乙醇漂洗。对照HE 染色切片刮取肿瘤安排，富集肿瘤细胞，依照白腊RNA 提取试剂盒标准流程提取肿瘤RNA；搜集新鲜血液，依照血液RNA 提取试剂盒标准流程提取血液RNA。运用核酸蛋白测定仪测定RNA产品的浓度和纯度。
1.3.2 RT-Q PCR反响 选用SYBR Green 荧光定量PCR办法。RT 反响系统：RNA 1 μg，补齐水至7 μl， 42℃ 2 min，然后参加0. 5 μl引物，0. 5 μl RT 酶，2 μl 缓冲液，42℃ 30 min，95℃ 5 min。反响完毕后加20 μl ddH2O 稀释。qPCR反响系统：MasterMix、模板cDNA、BRCA1、ERCC1、TS、β-actin 上下游引物（10 pmol/μl）和H2O 共5 μl 系统。扩增条件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环。熔解曲线的温度设定：95℃ 15 s，60℃ 15 s，95℃ 15 s。剖析RT-qPCR 数据，设定基线，以空白管不呈现阳性为准，每个意图基因做3个复孔，设定Ct值阈值归入规模为15～35个循环，得出意图基因BRCA1、ERCC1、TS 的CT值（3个复孔的均匀值）。以管家基因β-actin 基由于内参，得出ΔCT=CT意图基因-CTβ-actin。
1.4 统计学处理
数据选用SPSS 13.0 软件进行处理，计量材料用x±s表明，选用独立样本t查验或配对t查验，相关剖析选用Pearson相关剖析法，以P<0.05 为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 BRCA1、ERCC1、TS mRNA 在乳腺癌安排和对应血液中的表达
乳腺癌肿瘤白腊安排BRCA1 mRNA 表达的ΔCT为（7.516±2.257），对应血液样本BRCA1 mRNA 表达为（10.374±2.519）；肿瘤白腊安排ERCC1 mRNA 表达的ΔCT为（6.114±2.944），对应血液样本ERCC1 mRNA 表达为（8.801±2.581）；肿瘤白腊安排TS mRNA 表达的ΔCT为（5.950±2.604），对应血液样本TS mRNA 表达为（10.078±1.731）。样本间表达差异有统计学含义（P<0.05）（表1）。
表1 BRCA1、ERCC1、TS mRNA 在乳腺癌安排
和对应血液中的表达（x±s）
与血液安排ΔCT值比较，*P<0.05
2.2 乳腺癌白腊安排细胞和相应血液细胞BRCA1、ERCC1、TS mRNA表达的相关性剖析
Pearson 相关性剖析显现，BRCA1肿瘤白腊安排与血液安排的表达正相关（r=0.607，P<0.05）。ERCC1肿瘤白腊安排与血液安排的表达正相关（r=0.537，P<0.05）。TS肿瘤白腊安排与血液安排的表达无相关性（r=0.074，P>0.05）。BRCA1与ERCC1在肿瘤白腊安排中的表达无相关性（r=0.250，P>0.05）。BRCA1与TS在肿瘤白腊安排中的表达无相关性（r=0.256，P>0.05）。ERCC1与TS在肿瘤白腊安排中的表达无相关性（r=0.169，P>0.05）（图1）。
3 评论
乳腺癌是女人最常见的恶性肿瘤之一。全世界每年约有120万妇女患乳腺癌，50万死于乳腺癌。在西欧、北美等发达国家，乳腺癌发病率占女人恶性肿瘤的首位。值得重视的是，我国是乳腺癌发病率添加速度最快的国家之一，我国抗癌协会发布的统计数字显现，我国乳腺癌的发病率每年正在敏捷递加，成为城市死亡率添加最快的恶性肿瘤，发病年纪也呈逐步年轻化的趋势。临床医治上以彻底治愈性切除为主，术后常需辅佐化疗。2010 年NCCN 攻略提出关于Ⅱ、Ⅲ期乳腺癌患者可给予术前新辅佐化疗[2]。化效果果与肿瘤对化疗药物的耐药和副效果相关。个体化化疗有利于进步化效果果和防止药物的毒副反响，然后进步患者的生计质量，推迟生计期。化疗相关基因检测有助于个体化化疗计划的制定。
BRCA1 表达缺失容易发生细胞凋亡，一起对DNA 损害剂如顺铂等药物灵敏[18]。BRCA1 低表达的细胞株对紫杉醇类药物表现为耐药[9-11]；高表达示紫杉醇类化疗药物有活跃效果。ERCC1与铂类化效果果相关[12-13]，低表达者铂类药物化疗的效果好、毒副反响小及生计期长[14]。TS基因mRNA低水平表达，NCCN医治标准提示运用氟尿嘧啶、卡培他滨、培美曲赛等药物化疗有活跃效果[16-17]。
由于紫杉醇类是乳腺癌化疗计划中最多见的化疗药物，故咱们以紫杉醇类药物相关基因BRCA1mRNA表达为根底，剖析了其在肿瘤安排和血液细胞中表达的相关性以及其与年纪、ERCC1、TS mRNA表达的相关性。
成果表明，BRCA1肿瘤白腊安排与血液安排的表达正相关；ERCC1肿瘤白腊安排与血液安排的表达也呈正相关。有学者发现，血液胚系细胞ERCC1 基因多态性的表型同铂类效果和患者的生计时刻相关[19]。本研讨的成果在必定程度上也佐证了该学者的成果，由于ERCC1肿瘤白腊安排与血液安排的表达呈正相关，这一成果在必定程度上提示乳腺癌患者的血液标本或许能够代替其肿瘤白腊安排检测BRCA1和ERCC1 mRNA的表达，这将大大进步个体化分子检测的方便性，关于术前未进行手术切除的患者的新辅佐化疗也有活跃的指导含义。别的，TS肿瘤白腊安排与血液安排的表达无相关性，阐明不能用乳腺癌患者的血液标本代替其肿瘤白腊安排检测TS的表达。当然，还需要进一步添加样本数来验证这一成果。
别的，成果还显现，BRCA1与ERCC1、TS在肿瘤白腊安排中的表达无相关性。BRCA1的表达与紫杉醇类药物的化效果果相关，而ERCC1的表达与铂类用药相关，低表达者铂类药物化疗的效果好、毒副反响小及生计期长；TS与氟尿嘧啶、卡培他滨、培美曲赛等药物化疗有关，故在乳腺癌化疗计划挑选时，能够别离检测BRCA1、ERCC1、TS的表达，有助于紫杉醇类与铂类或许氟尿嘧啶、卡培他滨、培美曲赛等药物联合运用时的个体化挑选用药，以进步化效果果和削减毒副反响。
综上所述，乳腺癌患者的血液标本或许能够代替其肿瘤白腊安排检测BRCA1和ERCC1的表达。乳腺癌患者的BRCA1与ERCC1、TS的表达无相关性。
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（收稿日期：2014-07-06 本文修改：许俊琴）
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（收稿日期：2014-07-06 本文修改：许俊琴）
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（收稿日期：2014-07-06 本文修改：许俊琴）
