梁金龙+++张健莉+++罗守娟+等
[摘要] 意图 使用iTRAQ技能剖析绝经前后三阴性乳腺癌安排差异蛋白的表达状况，旨在评论绝经对三阴性乳腺癌发作的影响。 办法 挑选绝经前及绝经后各8例经病理确诊的三阴性乳腺癌患者，使用iTRAQ技能剖析差异蛋白明显性功用、差异蛋白pathway并进行差异蛋白验证。 成果 （1）绝经前差异蛋白相互效果组较会集，而绝经后的差异蛋白较多，且散布较散。（2）绝经前癌安排的差异蛋白存在于5种差异明显途径中；绝经后癌安排的差异蛋白存在于15种差异明显途径中。（3）与癌旁安排比较，绝经前共有214种明显差异蛋白，绝经后共有360种明显差异蛋白。绝经前的三阴性乳腺癌安排中上调蛋白81种，下调蛋白133种，绝经后上调蛋白157品种，下调203种。 定论 使用iTRAQ技能发现，绝经前后三阴性乳腺癌患者差异蛋白表达具有必定的特殊性，阐明不同雌激素环境下三阴性乳腺癌可能存在不同发病机制，可能成为医治TNBC的新靶点。
[关键词] 三阴性乳腺癌；绝经前后； iTRAQ技能；差异蛋白
[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）02-0001-04
三阴性乳腺癌（TNBC）是指孕激素受体（progesterone receptor，PR）、雌激素受体（estrogen receptor，ER）和人类表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2，Her-2）均为阴性表达的乳腺癌，其多发于初潮及足月怀孕年纪早、哺乳期短，特别是绝经前的妇女[1]。现在手术、化疗及新辅佐化疗和靶向医治为常用医治TNBC办法。其间分子靶向医治以肿瘤细胞的特征性改变为效果靶点，在发挥更强的抗肿瘤效果的一起削减对正常细胞的毒副效果。现在TNBC医治靶点的筛查作业已取得了必定的研讨进展，其间差异蛋白质组学的办法被以为是现在挑选TNBC临床医治靶点最为有用的研讨办法之一。差异蛋白质组学的办法首要包含双向凝胶电泳、双向荧光差异凝胶电泳、高效液相色谱技能、使用同位素符号相对和肯定定量（iTRAQ）技能等别离技能及质谱判定技能[2]。近年来人们对iTRAQ技能的使用日渐展开起来，但是将iTRAQ技能使用于三阴性乳腺癌机制研讨及靶向位点的评论至今仍较少。本研讨以绝经前和绝经后三阴性乳腺癌患者癌安排和癌旁正常安排为试验材料，使用iTRAQ技能剖析绝经前和绝经后三阴性乳腺癌和癌旁正常安排蛋白差异表达谱，进而剖析绝经前和绝经后差异蛋白的特异性，旨在评论绝经对三阴性乳腺癌发作发作的影响，然后为三阴性乳腺癌的医治供给依据。
1 材料与办法
1.1 临床材料
挑选2013年1月～2014年1月间我院收治的绝经前及绝经后各8例经病理确诊的三阴性乳腺癌患者，病理类型均为导管腺癌。绝经前8例TNBC患者的年纪规模为40～53岁。绝经后8例TNBC患者的年纪规模为59～81岁。16例三阴性乳腺癌患者的病例材料见表1。
1.2 试验进程
1.2.1 SDS-PAGE （1）安排标本处理：取术后新鲜的乳腺癌安排及距肿瘤5 cm以上的癌旁正常乳腺安排，切成小块，称重，分装，置-80℃的低温冰箱中保存备用。（2）总蛋白制备：①取50 μg低温冷冻的样品置于液氮预冷的研钵中，边参加液氮边研磨，直至样品出现白色粉末状，搜集到1.5 mL的EP管中。②参加500 μL LS，振动器混匀，超声波破碎，重复3次，每次距离3 min。③置冰上1 h，并间歇震动。④4℃，15 000 rpm离心30 min，重复2次，样品分层后用移液器小心肠将中层清液吸出放入1.5 mL EP管中。⑤向中清液参加丙酮/甲醛沉积液，冰上沉积2 h。⑥4℃，15 000 rpm离心20 min，弃上清，参加1 mL 100%丙酮，置于-20℃冰箱中沉积1 h。⑦参加80%丙酮1 mL，-20℃冰箱中沉积1 h，4℃，15 000 rpm离心15 min，留取沉积，在空气中晒干。⑧将250 μL 参加RS晒干沉积，涡旋振动器上混匀，30℃金属浴中孵育1 h。⑨4℃，15 000 rpm离心10 min，留取上清，即为安排总蛋白溶液。（3）总蛋白浓度测定：①预备两组8个1.5 mL离心管，每管各参加0、5、7.5、10、12.5、15、17.5和20 μL 0.5 mg/mL牛血清白蛋白，再别离参加20、15、12.5、10、 7.5、5、2.5、0 μL蛋白溶解液，再参加80 μL 0.15 mmol/L NaCl，以1号管不含牛血清白蛋白的作空白对照。②每管各参加1 mL考马斯亮蓝染料溶液。③比色测OD595。（4）SDS-PAGE：①预备SDS-PAGE凝胶。②将样品与SDS样品缓冲液混合，相同预备蛋白质分子量规范物。③上样：取15 μL蛋白样品上样，12% SDS-PAGE电泳，电极缓冲液为Tris-甘氨酸电泳缓冲液。按次第上样，必定安排已知分子量的规范物。④电泳。⑤取下凝胶，考马斯亮蓝或银染色染色调查剖析。
1.2.2 酶解及iTRAQ符号 （1）样品处理：每组取120 μg样品于30 μL SDT溶液，沸水浴5 min，冷却至室温。参加200 μL UA溶液混匀，转入30 kd超滤离心管，离心14000 g 15 min。参加200 μL UA溶液，离心14000 g 15 min，弃滤液。参加100 μL IAA，600 rpm振动1 min，避光室温30 min，离心14000 g 10 min。参加100 μL UA溶液，离心14000 g 10 min重复2次。参加100 μL 25 mM NH4HCO3，离心14000 g 10 min重复2次。参加40 μL Trypsin buffer 600 rpm振动1 min，37℃ 16～18 h。换新搜集管，离心14000 g 10 min，搜集滤液。（2）蛋白质含量测定：同1.2.1。（3）同位素符号：从每组取等量肽段（约100 μg），依照试剂盒阐明书进行符号。
1.2.3 肽段的别离及判定 别离进行强阳离子交流层析分级别离、毛细管高效液相色谱别离、ESI质谱判定。
1.3 数据剖析及处理
（1）质谱数据剖析：原始文件用iTRAQ Result Multiple File Distiller剖析定量数据，并用Sequest软件判定多肽分子。定量办法选用Identified iTRAQ Statistic Builder软件剖析，依据同位素报告基因的相对含量进行蛋白质定量。（2）生物信息学剖析：剖析差异蛋白在Gene Ontology数据库中的散布状况，使用Cluster软件进行蛋白功用注释，依据KEGG数据库对差异蛋白基因进行通路注释，得到差异蛋白基因所参加的一切的通路，使用Fisher准确查验核算每个通路的明显性水平，并对多重假设查验的成果进行校对并取得误判率，然后挑选出差异基因参加的明显通路[3]。
2 成果
2.1 绝经前后的TNBC患者差异蛋白明显性功用剖析
绝经前在已判定的差异量2倍以上的214种蛋白中，具有Go注释的有89种，其间12种蛋白参加小分子代谢，10种蛋白参加细胞粘附，7种参加炎症反响，7种参加调理基因表达。见封三图1。绝经后已判定的差异量2倍以上的360种蛋白中，具有Go注释的有156种，其间24种蛋白参加小分子代谢，12种蛋白参加细胞粘附，8种参加炎症反响，15种参加调理基因表达，12种具有信号转导功用，3种参加凋亡反响，17种发挥转运功用，20种参加血液凝结，2种参加细胞内蛋白代谢进程，见封三图2。将绝经前和绝经后明显差异蛋白收拾制作相互效果图谱，发现绝经前差异蛋白相互效果组较会集，而绝经后的差异蛋白较多，且散布较散。见封三图3、4。
2.2 绝经前后的TNBC患者差异蛋白Pathway剖析
依据KEGG数据库对差异基因进行Pathway注释，得到差异基因所参加的一切途径。绝经前有ECM-受体相互效果、蛋白质消化吸收、肾素-血管严重素体系、互补及凝结级联反响和集合粘附这5种途径为差异基因明显参加的途径。绝经后具有15种特异的Pathway，差异蛋白参加的途径包含粘着斑、在内质网内的蛋白质加工、丙酮酸的推陈出新、PPAR信号通路、谷胱甘肽推陈出新、葡萄球菌感染、核糖体、糖酵解、糖异生、补体、苯丙氨酸代谢、吞噬效果等。
2.3 绝经前后的TNBC患者差异蛋白验证剖析
选用iTRAQ技能不只可发现胞浆蛋白，还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白，并可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10 kD或大于200 kD的蛋白。成果显现，在绝经前后两组共判定1254种蛋白质，其间1243种有定量信息。挑选表达量差异2倍以上的作为明显差异蛋白，与乳腺癌旁安排比较，绝经前（premenopause）共有214种明显差异蛋白，绝经后（Hpost-menopauseH）共有360种明显差异蛋白（表2）。
表2 绝经前后TNBC患者明显差异蛋白（与乳腺癌旁安排比较）（个）
3 评论
三阴性乳腺癌其发病及致病机制比较复杂，激素环境一向被以为是TNBC致病潜在重要的影响因子之一[7]。经期是激素改变的明显阶段，绝经前与绝经后体内激素发作很大的改变，其间雌激素越多，绝经女人患某些乳腺癌的几率相对越大[4]。现在，尚无绝经与TNBC联系的研讨报导，是否绝经对三阴性乳腺癌发作具有影响，绝经前后不同激素水平条件下三阴性乳腺癌发作的机制是否存在差异，至今不知道。
三阴性乳腺癌的医治现在还没有一个清晰的、行之有用的靶向医治单剂，其间分子靶向医治是现在医治癌症的有用手法，且TNBC的医治靶点的筛查作业已取得了必定的研讨进展，其间差异蛋白质组学的办法被以为现在挑选临床医治靶点最为有用的研讨办法之一[5]。差异蛋白质组学的办法首要包含双向凝胶电泳、双向荧光差异凝胶电泳、高效液相色谱技能、使用同位素符号相对和肯定定量（iTRAQ）技能等别离技能及质谱判定技能。因为凝胶电泳仍具有低灵敏度、无法检测低丰度蛋白的限制，因而近期人们比较重视同位素符号相对和肯定定量（iTRAQ）技能的使用[6-8]。与凝胶为根底的定量办法比较，iTRAQ技能可捕获全蛋白、且无需凝胶电泳、一起可进行多样品剖析，然后成为研讨三阴性乳腺癌靶向位点的有力手法之一[9，10]。但是iTRAQ技能使用到三阴性乳腺癌机制研讨及靶向位点的探究至今仍较少。iTRAQ技能是选用4种或8种同位素的标签，经过特异性符号多肽的氨基基团，进行串联质谱剖析，可一起比较4种或8种不相同品中蛋白质的相对含量或肯定含量。Leroi D等[11]选用iTRAQ技能评论子宫内膜癌的差异蛋白，并发现chaperonin 10，pyruvate kinase M1 or M2 isozyme，calgizzarin等9种蛋白能够作为潜在的靶向医治位点。
本研讨使用iTRAQ技能结合2D LC-MS/MS，在绝经前和绝经后两组中共判定1254种蛋白质，其间1243种有定量信息。挑选表达量差异2倍以上的作为明显差异蛋白，与癌旁安排比较，绝经前共有214种明显差异蛋白，绝经后共有360种明显差异蛋白。其间与癌旁安排比较，绝经前的三阴性乳腺癌安排中上调蛋白81种，下调蛋白133种，绝经后上调蛋白157品种，下调203种，绝经前后差异蛋白表达并不完全一致，阐明绝经前后TNBC患者的蛋白表达状况具有必定的差异性及特殊性。在这些差异表达的蛋白中，有一些功用尚不非常清楚，而有一些与肿瘤密切相关。且本研讨将绝经前和绝经后明显差异蛋白收拾制作相互效果图谱（封三图3、4），成果显现，绝经前差异蛋白相互效果组较会集，而绝经后的差异蛋白较多，且散布较散。一起咱们对绝经前后的TNBC患者差异蛋白的通路剖析显现：绝经前癌安排的差异蛋白存在于5种差异明显途径中；绝经后癌安排的差异蛋白存在于15种差异明显途径中。绝经前后的TNBC患者一起存在的差异蛋白首要体现在三条明显途径，别离为ECM-受体相互效果途经、蛋白质消化吸收、肾素-血管严重素体系，而绝经后也有一起的差异明显通路，估测以绝经为边界，绝经前和绝经后的TNBC具有不同的致病机制[12]。一起的通路是三阴性乳腺癌的共性致病调控途径，而绝经后仍存在12种调控途径，包含粘着斑、在内质网内的蛋白质加工、丙酮酸的推陈出新、PPAR信号通路、谷胱甘肽推陈出新、葡萄球菌感染、核糖体、糖酵解、糖异生、补体、苯丙氨酸代谢、吞噬效果等相关蛋白，具有必定特性，因而依据绝经前后致病机制的不同，能够挑选不同的医治计划，为针对性医治三阴性乳腺癌指明方向。
总归，本研讨中咱们使用iTRAQ技能对绝经前后三阴性乳腺癌及癌旁正常安排的蛋白质组进行比较剖析，断定了差异表达的蛋白，并对这些蛋白进行了功用剖析，断定了这些差异蛋白明显参加的信号转导途径，但这些差异蛋白在绝经前后三阴性乳腺癌详细经过什么机制、怎么发挥效果还需要继续进行大样本进一步深化地研讨。
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（收稿日期：2014-10-30）
