朱汝森++陈兴贵++兰柳波+李锦宏++杨帆
[摘要]意图 检测人骨髓间充质干细胞（hMSCs）对脑胶质瘤细胞成长增殖的影响，评价运用hMSCs医治人脑胶质瘤的生物安全性。办法 获取hMSC的条件培育基（hMSCs-CM）；试验组人脑胶质瘤细胞U251培育于hMSCs-CM，对照组U251细胞培育于hMSCs-CM的基础培育基；以MTT试验检测细胞增殖才能的改变。成果 MTT成果显现，与对照组比较培育于hMSCs-CM的试验组U251细胞的增殖才能明显提高，差异有统计学含义（P<0.05）。定论 hMSCs-CM可促进脑胶质瘤细胞的增殖，对hMSCs运用于脑胶质瘤医治的生物安全性问题需引起注重。
[关键词]骨髓间充质干细胞；脑胶质瘤；基因医治；细胞增殖
[中图分类号] R318 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）04（b）-0013-03
Influence of human bone marrow mesenchymal stem cells on human glioma cells proliferation
ZHU Ru-sen1 CHEN Xin-gui2 LAN Liu-bo3 LI Jin-hong1 YANG Fan1
1.Department of Neurosurgery，the Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，Guangdong Province，Zhanjiang 524001，China；2.Cancer Center，the Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，Guangdong Province，Zhanjiang 524001，China；3.Institute of Biochemistry and Molecular Biology，Guangdong Medical University，Guangdong Province，Zhanjiang 524023，China
[Abstract]Objective To detect the influence of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells （hMSCs） on glioma cell proliferation and evaluate the biological safety of treating glioma with hMSCs.Methods The hMSCs-conditioned medium （hMSCs-CM） was obtained；human glioma cells U251 in the experiment group were cultured in hMSCs-CM，and U251 in the control group was cultured in the basal medium of hMSCs-CM；changes of cell proliferation were detected by MTT assay.Results The results of MTT assay showed that，compared with the control group，the proliferation of U251 of the experient group that cultured in hMSCs-CM increased significantly，and the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion hMSCs-CM can promote the proliferation of U251，and it is need to pay attention to the biological safety of treating glioma with hMSCs.
[Key words]Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells；Glioma；Gene therapy；Cells proliferation
骨髓間充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stromal cells，MSCs）因为具有在中枢神经系统中一起的搬迁性及对脑胶质瘤细胞的定向搬迁才能，在许多研讨中发现能够有效地将医治基因转送到脑胶质瘤中，以MSCs作为基因载体对脑胶质瘤进行靶向基因医治的研讨近年来成为热门[1-5]。现在更多的研讨所注重的是MSCs作为基因载体这种运用的有效性，而关于MSCs本身对脑胶质瘤细胞的效果未被注重。关于是否存在MSCs本身可促进脑胶质瘤细胞成长增殖的危险并未清晰，而这关系到运用MSCs医治脑胶质瘤的生物安全性问题。本试验经过检测人骨髓间充质干细胞（human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells，hMSCs）对人脑胶质瘤细胞成长增殖的影响，评价运用hMSCs医治人脑胶质瘤的生物安全性。
1材料与办法
1.1人骨髓间充质干细胞的获取和培育
在前期的研讨中现已建立了获取hMSCs的老练办法[6]。抽取健康成人志愿者的骨髓安排，于Percoll细胞别离液（瑞典Pharmacia）中经过密度梯度离心获取中心的有核细胞层，接种于培育瓶中，参加含10%胎牛血清的DMEM/F12培育基（美国Hyclone），置于37℃、5%CO2培育箱中培育，48 h后换液，去除未贴壁的细胞，每周替换培育液两次，待细胞密度达70%～80%后，以0.25% 胰酶+0.02% EDTA消化传代。取第2～10代的细胞作后续试验。
1.2人骨髓间充质干细胞诱导分解才能的检测
将第2～5代的hMSCs以0.25%胰酶+0.02% EDTA消化，按1×105个/cm2的密度培育于含有B27/N2（美国Gibco BRL）的无血清DMEM/F12培育液，并参加20 ng/ml的EGF和bFGF（美国Sigma），置于37℃、5%CO2培育箱中培育。培育液每周替换一次，成长因子每周增加2次。培育10～15 d后，神经球样结构可见构成。将神经球样结构的细胞以4%的甲醛固定，经过惯例免疫组化的办法检测神经干细胞标志性蛋白nestin的表达。免疫组化试验所运用的抗体及浓度为：兔抗人nestin，1∶500（美国Chemicon International）和山羊抗兔IgG Cy3，1∶100（美国Chemicon International）。细胞核以DAPI染色。
1.3人骨髓间充质干细胞的条件培育基（hMSCs-CM）的制备
将hMSCs以0.25%胰酶+0.02% EDTA消化，接种于75 cm2的培育皿，参加DMEM-F12加10%胎牛血清，培育于含5% CO2的37℃细胞培育箱，待细胞密度达70%～80%，以无血清的DMEM/F12洗刷，然后参加9 ml的DMEM/F12含0.1% BSA，培育3 d后，汲取培育液，经过离心（1000 g，5 min），并以孔径为0.22 μm的滤膜过滤，以去除细胞，取得hMSCs-CM。将基础培育基（DMEM/F12含0.1% BSA）作为试验的对照培育基（control medium）。
1.4 MTT试验检测hMSCs-CM对人脑胶质瘤细胞U251增殖的影响
将对数期U251细胞以1×103个/孔接种于96 孔板，正常培育24 h后，吸除原培育基，以无血清的DMEM/F12洗刷后，试验组参加200 μl hMSCs-CM，对照组参加200 μl对照培育基（control medium），每组设12个复孔。培育24 h后予换液，持续培育至48 h后，于每孔参加5 μg/ml MTT溶液20 μl，以37℃孵育4 h后，将上清液悉数弃去，每孔参加二甲亚砜（DMSO）溶液200 μl，溶解紫色结晶沉积，振动10 min，用酶标仪在570 nm处测定其光密度（OD值）。试验重复3次。
1.5统计学办法
选用SPSS 13.0统计学软件进行数据剖析，计量材料组间比较选用t查验，以P<0.05为差异有统计学含义。
2成果
2.1 hMSCs的获取和判定
取得的hMSCs经过传代培育后的呈长梭形，贴壁结实，经过诱导分解培育，hMSCs可构成相似神经干细胞构成的神经球样结构，组成神经球样结构的细胞高度表达神经干细胞标志性蛋白nestin（图1）。
2.2 hMSCs-CM对人脑胶质瘤细胞U251成长增殖的影响
取得hMSCs条件培育基（hMSCs-CM），将hMSCs-CM的基础培育基作为对照培育基。光镜下调查发现，培育于hMSCs-CM的人脑胶质瘤细胞U251与对照组比较，成长愈加旺盛（图2A）。MTT试验成果显现，培育于hMSCs-CM的试验组U251细胞增殖才能较对照组明显提高，差异有统计学含义（P<0.05）（图2B）。
3评论
脑胶质瘤是人类一种重要的肿瘤相关的致死要素，虽然经过广泛的外科切除及放疗、化疗等其他的医治手法，其预后一直以来都是很差；现行的规范医治手法对脑胶质瘤医治所存在的困难是与其瘤细胞向周围正常安排滋润性成长的特性密切相关[7-8]。正是胶质瘤细胞这种呈滋润性成长的特性也使得一些基因医治战略以及部分介入的医治办法亦难以很好地抵达滋润到周围正常安排的胶质肿瘤细胞[9-11]。MSCs根据其具有的在中枢神经系统中一起的搬迁特性以及其对胶质瘤细胞杰出的趋向性，能够有效地将意图医治基因输送到胶质瘤细胞，因而也为脑胶质瘤的基因医治带来了新的期望。
但是，在临床运用前，关于hMSCs在为基因载体对脑胶质瘤进行基因医治的生物安全性问题有必要得到完全的知道和清晰。有研讨报导，当MSCs和某些肿瘤细胞一起栽培时可表现出促进肿瘤成长的效果，其间包含乳腺癌[12-13]、卵巢癌[14]、黑色素瘤[15]及结肠癌[16]等。有研讨指出，MSCs可整合到肿瘤间质，并经过旁排泄一些细胞因子，包含CCL5、IL-6、及SDF-1α等促进肿瘤的成长[12-14]；MSCs可作为肿瘤前体的成纤维细胞经过分解和排泄促癌因子在肿瘤的发作开展中其重要效果[16]；MSCs亦可经过其免疫按捺的特性协助肿瘤细胞躲避宿主的免疫监控而促进肿瘤的发作和开展[15]。但是，也有研讨得到了一些相反的成果，发现MSCs与肿瘤细胞一起栽培能够按捺肿瘤的成长，包含结肠癌[17]、肝细胞癌[18]、黑色素瘤[19]等。好像关于MSCs移植后对肿瘤成长的效果是因肿瘤而异的，与一系列的要素有关，包含MSCs的獲取和培育的办法、试验的模型、移植到肿瘤中的细胞数量、在肿瘤微环境中的成长因子和炎症性细胞因子品种等要素[20]。
在本研讨中，笔者将人脑胶质瘤细胞U251于体外培育于人hMSCs的条件培育基中，发现相关于培育于对照培育基的U251细胞，前者的成长增殖愈加旺盛，MTT试验成果显现细胞的增殖才能明显提高，差异有统计学含义。hMSCs的条件培育根据体外可促进脑胶质瘤细胞的增殖，其效果机制有待进一步研讨，也提示临床工作者应该对hMSCs运用于脑胶质瘤医治的生物安全性问题需引起注重。
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（收稿日期：2017-02-27 本文編辑：任 念）
