李志军 范凯 宋颖
[摘要] 意图 通過查询总结输入性登革热的防治阅历，并树立Taqman MGB实时荧光PCR技能快速检测登革热病毒，更好地辅导往后登革热防制作业。 方法 盛行病学查询，运用Taqman MGB技能，依据登革病毒3端非编码区一段序列，规划登革1～4型荧光PCR通用引物和探针，以DF病毒株作为规范，以乙脑毒株作阴性对照，树立荧光PCR检测DF的快速方法。一起给予1份ELISA法检测阳性的临床血清标本进行荧光PCR扩增。 成果 选用PCR引物对登革1～4型病毒进行扩增，与规划相符；而乙型脑炎病毒均无非特异性扩增条带，对引物的相关性实验成果表明引物之间不会因彼此搅扰而呈现假阳性成果，1份疑似患者血标本RT-PCR扩增阳性率为83.3%（25/30），其核酸序列与登革1型病毒柬埔寨株以及我国1997、1999年盛行株GD14/97、GD05/99同源性别离为97%。 定论 在往后的登革热防控作业中，咱们运用RT-PCR检测方法时间短、灵敏性高、有较高的特异性，以此作为为DF的临床前期确诊方法；其次要点加强出国和归国人员的办理，展开登革热防治常识的宣传教育，树立和其他部分的登革热联防系统，加强底层医务人员登革热防治常识训练，进步底层医务人员登革热诊治水平，来到达操控登革热的方针。
[关键词] 输入性；登革热；监测；RT-PCR
[中图分类号] R512.8 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2018）09-0079-05
Survey， rapid detection method， prevention and control of first imported dengue fever of Jinzhou City in Liaoning Province
LI Zhijun1 FAN Kai2 SONG Ying2 LUO Mei3
1.Linghai Disease Control and Prevention Center in Liaoning Province， Linghai 121200， China； 2.Jinzhou Disease Control and Prevention Center in Liaoning Province， Jinzhou 121000， China； 3.Institute of Life Sciences， Jinzhou Medical University， Jinzhou 121000， China
[Abstract] Objective To summarize the experience of prevention and treatment of imported dengue fever by investigation and to establish Taqman MGB real-time fluorescence PCR to detect dengue virus rapidly so as to better guide dengue fever prevention and control work in the future. Methods The epidemiological investigation was carried out in the field. According to a highly conserved sequence of the non-coding region of dengue virus 3 'end， dengue 1.4 fluorescent PCR universal primer and Taqman MGB probe were designed， using Taqman MGB technique. The rapid detection method of real-time fluorescence PCR detection of dengue virus was established， with Dengue fever virus strain as the standard and JE as the control. The clinical serum sample of the one case of ELISA test positive were amplified by RT-PCR and fluorescent PCR amplification. Results The dengue virus type 1 to 4 were amplified using PCR primers， which was consistent with the design. However， there was no non-specific amplification band for Japanese encephalitis virus. The primer correlation experimental results showed that the false positive results would not occur due to mutual interference between the primers. The positive rate of RT-PCR amplification in one suspected patient's blood sample was 83.3% （25/30）. Its nucleotide sequence homology with dengue virus type 1 Cambodia， China GD14/97， GD05/99 in 1997 and 1999 was 97%. Conclusion In the prevention and control of dengue fever in the future， RT-PCR is a rapid， sensitive and specific method， which can be used as an early clinical diagnostic method for dengue fever. Second， we will focus on strengthening the management of overseas personnel and returnees， develop the publicity and education of dengue fever prevention and treatment. We also establish the defense system of dengue fever with other departments， strengthen the training on dengue fever prevention and control among grassroots medical workers and improve the level of diagnosis and treatment of dengue fever among grassroots medical workers so as to achieve the goal of controlling dengue fever.
[Key words] Input；Dengue fever；Monitoring；RT-PCR
登革热和登革出血热是一种急性感染病，是热带、亚热带区域的严峻公共卫生问题，由登革热病毒经蚊媒传达[1]。据有关权威部分的数据计算，全球每年约有7千万到1亿人感染DF病毒，每年24 000人逝世[2]。锦州市归于登革热非盛行区从20世纪50年代初有疫情记载以来，无登革热病本地感染病例。锦州市疾控中心于2015年2月15日对一例输入性登革热病例进行查询处理，现报导如下。
1 资料与方法
1.1 个案查询
依据《登革热盛行病学个案查询表》进行病例查询，查看病例资料。确诊规范参照《登革热确诊规范及处理准则》（WS 216-2008）[3]。
1.2 实验室查看及病原学查看
检测血、尿和粪便惯例及血清生化项目等；由锦州医科大学隶属榜首医院查验科选用荧光PCR法对收集的病例急性期血清标本进行病原学检测。
1.2.1 资料 乙脑病毒疫苗株由上海生物制品所供给。阳性血清标本采自于锦州市近期发病1周内的登革热患者和发病10 d内的乙型脑炎患者，-86℃保存。一切阳性临床血清标本依据实验室IgM、IgG检测为阳性进行确诊。DV1～4型基因组RNA由广东省疾病防备操控中心供给，TaqDNA聚合酶、dNTPs、DL2000 Marker、DNA 衔接酶、DNA质粒提取试剂盒、DNA胶收回试剂盒、pMD18-T载体等购于大连TaKaRa公司，其他惯例试剂均为国产剖析纯。
1.2.2 RNA提取 1～4型DF病毒规范株选用1640培育基进行溶解，接种C6/36细胞，20℃～33℃进行培育、传代，按病毒提取RNA试剂盒说明书进行提取，一起-86℃保存备用。
1.2.3 反转录与 PCR扩增 RNA反转录 反响整体积为40 μL，在反响管内顺次参加：10×缓冲液 10 μL，510 mmol/L 8×dNTP 2 μL，0.3 U/μL Random（金斯瑞公司出产）引物1 μL，RNA 12 μL，AMV Reverse Transcriptase（10 μL）1 μL混匀。反响条件：42℃ 60 min，95℃ 5 min，4℃保存。产品放置于-20℃备用。
PCR扩增：反响整体积为20 μL，在反响管内顺次参加：10×PCR Buffer 2 μL，dNTP Mixture（10 mM） 1 μL，通用引物D1、D2（5 μmol/L）各1 μL，cDNA 0.5 μL（Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅳ型）、2 μL（Ⅲ型、血清标本、阴性对照），ExTaq酶（5 U/μL）0.25 μL加H2O补足系统。
1.2.4 实时荧光PCR 需反响的整体积为40 μL，在管内顺次参加：20×缓冲液4 μL，10 mmol/L MgCl2 2.5 μL，引物DenFP、DF-RP（10 μmol/L）各0.5 μL（Ⅰ型，Ⅱ型，Ⅳ型），2 μL（Ⅲ型，血清标本，阴性对照）Taq酶（5 U/μL）0.25 μL加H2O补足系统。反响条件：50℃ 2 min，95℃10 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，进行40个循环，4℃保存。选用MX4000实时荧光PCR扩增仪进行扩增，Tm值由扩增片段的长度决议，延伸阶段检测荧光。
1.2.5 疑似DF患者血清标本PCR扩增 挑选锦州凌海市疾控中心1例疑似DF患者发病前期的血清标本进行多重PCR扩增。
1.2.6 基因克隆、判定和测序 扩增阳性PCR产品依照上海金斯瑞生物技能有限公司的DNA凝胶收回试剂盒说明书进行实验，收回产品衔接至pMD18-T载体并转化JM109宿主菌，将摇好的菌液经DNA质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取，PCR及酶切判定后，送至大连宝生物公司测序。
1.3 PCR检测的特异性实验
以DV1～4型病毒为阳性对照，不加DNA模板组、盛行性乙型脑炎病毒均为阴性对照，运用相同方法进行扩增，验证多重PCR的特异性。
1.3.1 PCR检测灵敏实验 取DV1～4型细胞培育液进行1∶10稀释，稀释后别离取300 μL进行核酸提取，按上述方法进行RT-PCR，取5 μL RT-PCR产品作为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳查询成果。验证RT-PCR的灵敏性，一起DV1～4型特异性引物进行单引物扩增，以比照单引物和多引物灵敏性的差异，见图1。
M 1 2 3 4 5 6
M：分子量规范DL2000；1：陰性对照；2盛行性乙型脑炎病毒；3：DV 4 型；4：DV 3 型；5：DV 2 型；6：DV 1 型
1.3.2 PCR检测DV的灵敏性 灵敏度：以DEN-1（图2A）为例，1×103 copies/mL浓度核酸可见扩增曲线，1×102 copies/mL未见显着扩增曲线，故 DEN-1检测限为1×103 copies/mL，DEN-2 为1×102 copies/mL（图2B），DEN-3为1×102 copies/mL（图2C），DEN-4为1×102 copies/mL（图2D）。
1.3.3 临床疑似DF患者批标本检测成果 RT-PCR扩增1份前期患者血标本，阳性率为83.3%（图3）。2株阳性率为83.3%。2株阳性标本经克隆测序后，与DV1型柬埔寨株以及我国1997、1999年DV1型盛行株同源性别离为97%、97%、98%，进一步证实为DV1（图3）。
2 成果
2.1盛行病学史
患者安某，纳米比亚籍，女，27岁，辽宁锦州某大学本科留学生。自述2015年1月17日去马来西亚旅行，2月12日经广州白云机场起色回辽宁锦州，在广州机场经入境查验，确诊登革热病毒核酸阳性，但患者回绝在广州医治，于当晚16时回来锦州校园。
2.2 临床症状和医治状况
该患者于2月15日13时由同学陪同来锦州市疾控中心，问询是否有登革热医治的特效药物。问询得知其在12日发热，最高体温38.9℃，伴头痛、肌肉痛，无其他症状。患病期间自行服退热药物，13日晚上19点到某医学院隶属榜首院就诊，接诊医师开始问诊验血后，送查看验科运用Taqman MGB实时荧光PCR检测，确诊登革热临床病例但没有及时上报。
2.3实验室查看临床查验成果
血白细胞计数2.49×109/L，中性粒细胞百分数75.5%，血小板计数76×109/L，异性淋巴细胞（-）；尿潜血（-），尿蛋白质（-），尿白细胞（-），白蛋白28 g/L。
2.4 查询处置状况
病例在马来西亚旅行期间有蚊虫吸食史，否定4周内有感染病患者触摸史，否定两周内有家禽鸟类密切触摸史，自述在广州机场经出入境部分确诊登革热，但无任何书面资料。2月15日收集患者血液标本，于2月16日上送省疾控中心进一步查验，在等候成果期间，我中心2月17日上午10时接到市卫计委转发的广东出入境查验检疫局《关于从2月12日入境人员中检出一例输入性登革热病例的状况通报》，市疾控中心17日11时经过我国疾病防备操控信息系统对该病例进行网络直报，并一起将该状况上报省疾控中心。18日辽宁省疾控中心检测成果为急性期血清登革热病毒核酸阳性。
2.5确诊依据依据《登革热确诊规范及处理准则》（WS216-2008）[3]
该病例有清晰盛行病学史，结合临床体现、实验室查看及病原学检测成果，确诊为输入性登革热实验室病例。
2.6 防治方法和作用点评
疾控中心主张病例到市感染病医院进行诊治，但患者因身体已无不适体现，回绝入院医治，疾控人员对该患者进行登革热防治常识的健康宣教，奉告登革热无特效药物，对症医治为主，叮咛其操控体温，多喝水、歇息，如病况改变到医院作进一步医治。树立联防机制，清晰校园职责人和联络方式，辅导该所大学展开登革热防制作业，经15 d医学查询，该患者的密切触摸人员无二代病例发作，患者康复。二月份我区域处于冬天，外环境无蚊虫活动，故没有展开蚊媒监测和消杀作业。
3 评论
登革热的临床确诊阅历了多种方法，现在逆转录式PCR 方法现已运用DF与黄病毒属的其他成员的辨别以及DF的类型辨别[4-5]。除了在病毒基因组中挑选的特异性区域方位以及产品巨细有所不同外，逆转录一套式PCR判定登革热病毒的型别所选用的原理根本共同，这方面已多有报导[6-10]运用一对通用引物，扩增DV1～4型病毒的3结尾非编码区的核酸序列成果表明，该引物能够将登革病毒和同归于黄病毒科的其他病毒区别，如日本脑炎病毒、黄热病病毒等[11-13]。
我国东北区域以往发作登革热病例状况很少见。依据本例输入性登革热病例的查询和处理，提示咱们在往后的登革热防制作业中要点做好如下作业[14]：
首要，要加强对去登革热高发区域出国人员的办理，加强登革热防治常识的宣传教育，进步自我保护认识，归国后应先到到疾病操控部分树立健康档案，一旦呈现相关症状要及时到医院就诊，以早发现、早确诊、早医治，避免输入性DF的分散[15-16]。近几年来跟着对外经贸关系的展开，锦州市赴东南亚等国家和区域务工、旅行、学习的人员越来越多，登革热输入病例危险有添加趋势。我国登革热的防控现阶段主要是依托避免感染源的传入、操控蚊媒的方法来防备和操控登革热的传达[17]。
其次，该病例疾控中心能及时展开盛行病查询，查清相关信息，规范处理操控疫情，无二代病例呈现得益于疫情联防联控机制充沛有用的执行。该病例首诊医师未能规范上报疫情[18]，提示在往后输入性感染病防控方面，加强底层医务作业者对DF常识训练，进步DF疫情陈述认识；有关部分对卫生检疫、商务、外事有关部分的联络，及时把握外派人员特别是到疫情高发区域人员的相关信息，回国后健康状况呈现改变时疾控部分能及时查询和处理[19-20]。
最终，锦州前史蚊媒监测数据显现无伊蚊前言，该输入病例提示咱们在往后的监测作业中要重视登革热传达前言伊蚊的监测，执行防蚊灭蚊方法，即可阻断登革热传达，根绝二代病例的发作[5]。
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（收稿日期：2017-12-09）
