陈永畅+邓之婧+陈诚+柯晶晶+吴艳秋+王向坤+何萍
[摘要] 意图 树立小鼠局灶性脑缺血再灌注（I/R）模型并予以点评。 办法 将昆明小鼠60只随机分为假手术组30只，I/R模型组30只。改善线栓法制备小鼠大脑中动脉堵塞/再灌注（MCAO/R）模型。经过神经行为学评分、氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法测定脑梗死比（%）、干湿重法测定脑含水量（%）及HE染色调查脑安排病理改动点评模型牢靠性。 成果 模型存活率为83.33%，造模总成功率为76.67％。假手术组的小鼠神经行为学评分为0分，脑梗死比为0，脑含水量（77.29±0.45）%。I/R模型组的小鼠神经行为学评分为（2.42±0.63）分，脑梗死比为（23.03±3.42）％，脑含水量（83.18±1.65）%，均较假手术组显着增高（P<0.01）；病理查看呈现典型脑梗死病理改动。 定论 改善线栓法成功树立简洁、牢靠的小鼠局灶性I/R模型。
[关键词] 小鼠；脑缺血再灌注；大脑中动脉堵塞；动物模型
[中图分类号] R332[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721（2014）05（c）-0004-04
Establishment and evaluation of focal cerebral ischemia-reperfusion model in mice
CHEN Yong-chang DENG Zhi-jing CHEN Cheng KE Jing-jing WU Yan-qiu WANG Xiang-kun HE Ping▲
Pharmaceutical College,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China
[Abstract] Objective To establish and evaluate the focal cerebral ischemia-reperfusion (I/R) model in mice. Methods Sixty Kunming mice were randomly divided into the sham group (n=30) and the I/R model group (n=30).The middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model was established by the improved intraluminal filament technique in mice.The reliability of the model was evaluated by the neurologic behavior score,cerebral infarction rate determined by triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining method,brain water content determined by dry-wet method,and brain histopathological change observed. Results The survival rate and total success rate of the model was 83.33% and 76.67％respectively.In the sham group,the neurologic behavior score was 0 point,the cerebral infarction rate was 0,and the brain water content was(77.29±0.45)%.In the I/R group,the neurologic behavior score was(2.42±0.53)points,the cerebral infarction rate was (23.03±3.42)％,and the brain water content was(83.18±2.35)%,and compared with the sham group,the above-mentioned indicators in the I/R model group were all markedly increased (P<0.01).At the same time,the typical pathological change of cerebral infarctionwas also observed in the I/R group. Conclusion The simple and reliable focal cerebral I/R model has been successfully established by improved intraluminal filament technique in mice.
[Key words] Mice;Cerebral ischemia-reperfusion;Middle cerebral artery occlusion;Animal model
缺血性脑血管病约占悉数脑血管病的80%，具有高发病率、高患病率、高逝世率、高致残率、高复发率的特色，已成为严重危害人类健康的三大疾病之一[1]。大脑中动脉是脑梗死的多发部位，占脑梗死的60%以上；大脑中动脉堵塞/再灌注（MCAO/R）模型是现在运用最为广泛的、研讨局灶性脑缺血再灌注危害的抱负模型，以往多选用大鼠作为研讨目标[2-3]。近年来，鉴于小鼠体重差异小，模型成功率较高，其脑缺血更挨近于人类脑供血缺乏或脑梗死再灌时脑安排病理生理演化进程等长处，故小鼠脑缺血模型成为研讨脑梗死后神经细胞逝世、神经功用修正及药物维护效果的重要动物模型[4-5]，因此，树立简洁、牢靠、安稳的小鼠脑缺血再灌注模型是研讨脑缺血再灌注危害的重要手法。本研讨评论树立小鼠MCAO/R致局灶性脑缺血再灌注模型的办法，并对造模办法进行优化、改善及点评。
1 材料与办法
1.1 首要药品、试剂与材料
2，3，5-氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）（美国Amresco，批号2603c312）；0.6号尼龙渔线（日本YunHai公司，直径0.12 mm，批号20120312）；704硅橡胶（溧阳市庞大胶业有限公司，批号20130526）；戊巴比妥钠（美国Sigma，批号051135）。
1.2 首要仪器设备
XTZ-D解剖显微镜（上海光学五厂）；DMR+Q550病理图画分析仪（德国Leica）。
1.3 动物分组与试验办法
1.3.1 试验动物动物成年SPF级雄性昆明种小鼠60只，体质量为25~30g，由广西医科大学试验动物中心供给，动物合格证号：SCXK桂2003-003；随机分为假手术组30只，I/R模型组30只。
1.3.2 线栓制备尼龙渔线用尖利剃须刀片切开为4 cm/段，头端0.5 cm均匀包裹704硅橡胶，室温固化24 h后，镜下挑选头端润滑圆钝、直径为0.20~0.23 mm的线栓备用。试验前用记号笔在线栓间隔头端4 mm及8~9 mm处涂色符号，浸泡于生理盐水中备用。
1.3.3 模型制备参阅唐颖馨等[6-7]的办法选用改善线栓法制造小鼠MCAO/R模型并做恰当改善，将线栓自颈总动脉经颈内动脉刺进MCAO开始部，但手术进程中仅别离结扎颈总动脉，不别离结扎颈外动脉或翼腭动脉，也无需别离颈内动脉。腹腔打针1%戊巴比妥钠0.2 ml/只麻醉小鼠后，仰卧固定，解剖显微镜下行颈部正中切断。镜下用显微镊别离左边颈总动脉约4 mm至颈内动脉和颈外动脉分叉处并穿双线备用，期间留意避免牵拉危害迷走神经。结扎颈总动脉近心端并用微动脉夹在颈总动脉分叉下方夹闭颈总动脉血流后，在间隔颈总动脉分叉下方约3 mm处用显微剪剪开一小口，刺进线栓并用预留丝线固定在颈总动脉上，固定松紧度以能推进线栓为宜。此刻松开微动脉夹，将线栓缓慢沿颈总动脉刺进颈内动脉，操作进程中留意栓线走行方向勿入颈外动脉或翼腭动脉。线栓刺进深度距颈总动脉分叉约4 mm时，提示线栓挨近颈内动脉入颅点；刺进深度距颈总动脉分叉8~9 mm时，此刻有细微阻力感，提示线栓头端抵达大脑中动脉开始部。扎紧丝线以固定线栓，缝合切断，留意术后保温，待动物复苏后独自置于养殖笼中。缺血3 h后，当心拔出栓线并结扎颈总动脉残端，再灌注24 h。假手术组只别离和结扎左边颈总动脉，不刺进线栓，其他操作过程同I/R模型组。
1.3.4 神经行为学评分一切试验小鼠在再灌注24 h后选用Bederson评分规范[8]进行神经行为学评分。0分：无神经功用残缺症状；1分：提尾时，右前肢委曲；2分：右侧推阻力下降，伴前肢委曲，无转圈行为；3分：同2分行为，一起伴自发性向右侧转圈；4分：没有自发活动。以神经行为学评分≥1分为模型成功规范。
1.3.5 TTC染色测定脑梗死比[9]神经行为学评分后，随机挑选10只假手术组及神经行为学评分≥1分的10只I/R模型小鼠，断头取脑，置-20℃冰箱中冷冻20 min。去除嗅脑、小脑及脑干，沿脑前级和视穿插中点、视穿插、漏斗部作冠状切片，共4片。用0.5%TTC 溶液37℃孵育脑片10 min后，滤纸汲取外表液体后，别离各脑片白色区（梗死区）和赤色区（正常区）后分别称重，按下式核算脑梗死比：脑梗死比（%）=（梗死区分量-脑片总分量）/脑片总分量×100%。
1.3.6 干湿重法测定脑含水量[10]神经行为学评分后，随机挑选10只假手术组及神经行为学评分≥1分的10只I/R模型小鼠，断头取脑，去除嗅脑、小脑及脑干，沿中线分为左右半球后称湿重，并置100℃烘箱内24 h烘干后称干重。脑含水量（%）=（湿重-干重）/湿重×100%。
1.3.7 脑安排病理学调查神经行为学评分后，随机挑选3只假手术组及神经行为学评分≥1分的3只I/R模型小鼠，全身4%多聚甲醛灌流后断头取脑， 4 μm接连冠状切片，惯例HE染色后，光镜下调查脑安排病理改动。
1.4 统计学处理
数据选用SPSS 11.5软件进行统计学处理，计量材料用x±s表明，选用独立样本t查验，以P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 造模成功率和两组神经行为学评分的比较
假手术组小鼠术后无神经功用残缺症状，神经行为学评分为0分。再灌注24 h后，I/R模型组小鼠存活25只，存活率为83.33%（25/30）；其间无神经功用残缺症状者2只，经TTC染色证实无梗死灶；神经行为学评分≥1分者23只，神经行为学评分为（2.42±0.63）分，两组的神经行为学评分比较差异有统计学含义（P<0.01）。造模总成功率为76.67％（23/30）。
2.2 两组TTC染色及脑梗死比的比较
假手术组脑片TTC染色呈全脑均匀红染，未见白色梗死灶，脑梗死比为0；I/R模型组脑片呈现左边皮层及皮层下白色梗死区，首要会集在第2、3脑片，脑梗死比为（23.03±3.42）％，两组的脑梗死比比较差异有统计学含义（P<0.01）。小鼠脑TTC染色见图1。
图1 小鼠脑TTC染色成果
A.假手术组；B.I/R模型组
2.3 两组脑含水量的比较
假手术组左右脑对称，脑含水量为（77.29±0.45）%；I/R模型组可见左边大脑体积增大，脑含水量为（83.18±1.65）％，两组的脑含水量比较差异有统计学含义（P<0.01）。
2.4 两组脑安排病理改动的比较
假手术组皮层和纹状体神经元数量、形状结构正常，神经纤维密布，摆放规整。I/R模型组缺血侧脑安排可见很多筛状坏死灶，坏死灶内神经元数量显着削减，呈现核固缩、浓染；神经纤维稀少，摆放紊乱，空隙扩展；间质水肿显着。小鼠脑安排病理学改动见图2。
图2 小鼠脑安排病理学改动图（HE染色，400×）
A.假手术组；B.I/R模型组
3 评论
3.1 试验动物的挑选
动物品系的挑选对MCAO模型的成功率／术后梗死体积的巨细及区域有必定的影响[11]。杜芳等[12]研讨以为，线栓法制造昆明小鼠大脑中动脉堵塞再灌注模型伤口小，缺血的部位较安稳，能够精确操控缺血和再灌注时刻，能够成为研讨脑血管疾病的病理生理改动、预后及医治效果的抱负试验动物模型；与BALB/c小鼠（另一种常用于制备MCAO/R模型的小鼠），昆明小鼠制造MCAO/R模型的存活率、模型成功率显着高于BALB/c小鼠，而梗死体积仅略低于BALB/c小鼠，因此，本研讨选用昆明小鼠树立MCAO/R模型，并对造模办法进行优化改善。
3.2 线栓的制备及进栓深度
线栓是MCAO模型制备成功的关键因素之一[13]。704硅橡胶是一种黏接性好、高强度、无腐蚀的单组分室温硫化硅橡胶，具有安全无毒、可塑性好、常温固化、运用便利等特色。与常用的白腊包裹线栓比较，704硅橡胶包裹的线栓形状均匀共同，头端包裹圆润，栓体润滑及固化后不易危害变形或掉落等，然后进步模型成功率和安稳性。
进栓深度是MCAO模型制形成功的另一重要因素。关于小鼠MCAO模型进线深度的报导不多，多引荐进线深度超越颈总动脉分叉处8～9 mm[7，14]。本研讨发现，关于昆明小鼠，刺进深度以超越颈总动脉分叉处8 mm 为宜，进线过深则会导致梗死面积过大，动物逝世率增高。
线栓除了在间隔头端8~9 mm处涂色符号外，还增加了间隔头端4 mm处进行符号。4 mm符号点有助于判断线栓是否入颅，8~9 mm符号点则有助于判断线栓头端是否抵达大脑中动脉开始部，由此进步线栓刺进成功率。
3.3 进栓办法的挑选
线栓法制备MCAO模型不需求开颅，侵入性小，操作便利而且能够发生相对安稳的脑缺血病灶，术后动物生计状况安稳，但longa传统线栓法[2，14]从颈外动脉断端刺进线栓至大脑中动脉，需求别离结扎颈外动脉远端及其一切分支，造模时刻长，动物出血多，逝世率高。现在在制备大鼠MCAO模型中常用改善线栓法，术中将线栓自颈总动脉经颈内动脉刺进大脑中动脉开始部，使大脑中动脉供血区域发生局灶性脑缺血；拔除线栓后，依托Wills环由对侧颈总动脉供血而完结再灌[15]。昆明种小鼠的Willis环解剖结构相对安稳，变异较少，后交通动脉多发育杰出，90%有完好的Willis环[16]，因此选用改善线栓法制备MCAO模型后拔除线栓，仍可经过Willis环到达再灌的意图。
改善线栓法[6，7，15]操作中，常别离结扎颈外动脉和（或）翼腭动脉以避免线栓误入颈外动脉或翼腭动脉；微动脉夹闭方位挑选在颈内动脉，因此需别离颈内动脉开始段，由此形成手术时刻延伸、手术难度加大，乃至导致术中出血、动物逝世。本研讨测验仅别离结扎颈总动脉，不别离结扎颈外动脉或翼腭动脉，而是经过调整刺进线栓刺进方向将线栓刺进颈内动脉；一起将颈总动脉开口挑选在颈总动脉分叉下方约3 mm处，因此微动脉夹夹闭方位能够挑选在颈总动脉分叉下方而非颈内动脉，因此也无需别离颈内动脉。手术办法更简略，手术时刻一般可操控在10 min内完结，一起也下降了术中出血的可能，亦避免了对颈总动脉分叉周围区域血管、颈上神经节及颈交感干、迷走神经及其分支的危害，进步动物术后恢复能力，下降逝世率。
3.4 模型的点评
经神经行为学评分、TTC染色脑梗死比测定、脑含水量及脑安排病理改动检测，I/R模型组小鼠造模后呈现显着神经功用残缺症状，神经行为学评分显着高于假手术组；脑安排TTC染色呈皮质及皮层下白色梗死灶，脑梗死比和脑含水量亦显着高于假手术组，脑安排病理契合脑缺血再灌注危害病理改动，提示造模成功。
综上所述，本研讨成功选用改善线栓MCAO/R法制备小鼠局灶性脑缺血再灌模型，该改善办法制造简略易行，成功率较高，成果安稳、牢靠，可用于脑缺血再灌注的研讨。
[参阅文献]
[1]黄玉兰，杨肖敏，石广霞.各种脑缺血动物模型研讨现状[J].我国中医急症，2011，20（12）：1985-1987.
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[14]赵瑾，苑琳，王驭龙，等.线栓法仿制昆明小鼠局灶性脑缺血再灌注模型的安稳性研讨[J].我国病理生理杂志，2011，27（7）：1450-1452，1456.
[15]梁盼，陈伟建，杨运俊，等.改善线栓法制备大鼠大脑中动脉堵塞模型[J].浙江医学，2011，33（10）：1483-1485.
[16]巨大宽，章翔，蒋晓帆，等.小鼠脑Willis环的解剖及其对局灶性脑缺血模型的影响[J].陕西医学杂志，2006， 35（1）：3-5，17.
（收稿日期：2014-03-26本文修改：许俊琴）
[基金项目] 国家自然科学基金（81360056）；广西自然科学基金面上项目（2013GXNSFAA019147）；广西自然科学基金回国基金项目（2012GXNSFCA053005）；广西研讨生教育立异方案项目（YCSZ2012032）；广西医科大学“未来学术之星”大学生课外科研课题项目
[作者简介] 陈永畅（1985-），女，原籍：广西桂林，广西医科大学2011级硕士研讨生，首要从事神经药理学研讨
▲通讯作者：何萍（1975-），女，原籍：湖南岳阳，教授，硕士生导师，首要从事神经药理学研讨
改善线栓法[6，7，15]操作中，常别离结扎颈外动脉和（或）翼腭动脉以避免线栓误入颈外动脉或翼腭动脉；微动脉夹闭方位挑选在颈内动脉，因此需别离颈内动脉开始段，由此形成手术时刻延伸、手术难度加大，乃至导致术中出血、动物逝世。本研讨测验仅别离结扎颈总动脉，不别离结扎颈外动脉或翼腭动脉，而是经过调整刺进线栓刺进方向将线栓刺进颈内动脉；一起将颈总动脉开口挑选在颈总动脉分叉下方约3 mm处，因此微动脉夹夹闭方位能够挑选在颈总动脉分叉下方而非颈内动脉，因此也无需别离颈内动脉。手术办法更简略，手术时刻一般可操控在10 min内完结，一起也下降了术中出血的可能，亦避免了对颈总动脉分叉周围区域血管、颈上神经节及颈交感干、迷走神经及其分支的危害，进步动物术后恢复能力，下降逝世率。
3.4 模型的点评
经神经行为学评分、TTC染色脑梗死比测定、脑含水量及脑安排病理改动检测，I/R模型组小鼠造模后呈现显着神经功用残缺症状，神经行为学评分显着高于假手术组；脑安排TTC染色呈皮质及皮层下白色梗死灶，脑梗死比和脑含水量亦显着高于假手术组，脑安排病理契合脑缺血再灌注危害病理改动，提示造模成功。
综上所述，本研讨成功选用改善线栓MCAO/R法制备小鼠局灶性脑缺血再灌模型，该改善办法制造简略易行，成功率较高，成果安稳、牢靠，可用于脑缺血再灌注的研讨。
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[13]甄毅岚，王亚男，李晟，等.线栓法制备不同体重KM小鼠局灶性脑缺血/再灌注模型的树立及点评[J].我国试验动物学报，2013，21（2）：39-44.
[14]赵瑾，苑琳，王驭龙，等.线栓法仿制昆明小鼠局灶性脑缺血再灌注模型的安稳性研讨[J].我国病理生理杂志，2011，27（7）：1450-1452，1456.
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[16]巨大宽，章翔，蒋晓帆，等.小鼠脑Willis环的解剖及其对局灶性脑缺血模型的影响[J].陕西医学杂志，2006， 35（1）：3-5，17.
（收稿日期：2014-03-26本文修改：许俊琴）
[基金项目] 国家自然科学基金（81360056）；广西自然科学基金面上项目（2013GXNSFAA019147）；广西自然科学基金回国基金项目（2012GXNSFCA053005）；广西研讨生教育立异方案项目（YCSZ2012032）；广西医科大学“未来学术之星”大学生课外科研课题项目
[作者简介] 陈永畅（1985-），女，原籍：广西桂林，广西医科大学2011级硕士研讨生，首要从事神经药理学研讨
▲通讯作者：何萍（1975-），女，原籍：湖南岳阳，教授，硕士生导师，首要从事神经药理学研讨
改善线栓法[6，7，15]操作中，常别离结扎颈外动脉和（或）翼腭动脉以避免线栓误入颈外动脉或翼腭动脉；微动脉夹闭方位挑选在颈内动脉，因此需别离颈内动脉开始段，由此形成手术时刻延伸、手术难度加大，乃至导致术中出血、动物逝世。本研讨测验仅别离结扎颈总动脉，不别离结扎颈外动脉或翼腭动脉，而是经过调整刺进线栓刺进方向将线栓刺进颈内动脉；一起将颈总动脉开口挑选在颈总动脉分叉下方约3 mm处，因此微动脉夹夹闭方位能够挑选在颈总动脉分叉下方而非颈内动脉，因此也无需别离颈内动脉。手术办法更简略，手术时刻一般可操控在10 min内完结，一起也下降了术中出血的可能，亦避免了对颈总动脉分叉周围区域血管、颈上神经节及颈交感干、迷走神经及其分支的危害，进步动物术后恢复能力，下降逝世率。
3.4 模型的点评
经神经行为学评分、TTC染色脑梗死比测定、脑含水量及脑安排病理改动检测，I/R模型组小鼠造模后呈现显着神经功用残缺症状，神经行为学评分显着高于假手术组；脑安排TTC染色呈皮质及皮层下白色梗死灶，脑梗死比和脑含水量亦显着高于假手术组，脑安排病理契合脑缺血再灌注危害病理改动，提示造模成功。
综上所述，本研讨成功选用改善线栓MCAO/R法制备小鼠局灶性脑缺血再灌模型，该改善办法制造简略易行，成功率较高，成果安稳、牢靠，可用于脑缺血再灌注的研讨。
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[4]马丛，王蕾.小鼠脑缺血再灌注模型办法及中药的药理效果[J].中华中医药学刊，2008，26（2）：280-282
[5]邹永杰.脑缺血动物模型的研讨发展[J].世界神经病学神经外科学杂志，2012，39（5）：423-426.
[6]唐颖馨，刘敏珍，丁凤菲，等.小鼠大脑中动脉栓塞模型的改善及点评[J].神经危害与功用重建，2012，7（2）：79-83.
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（收稿日期：2014-03-26本文修改：许俊琴）
[基金项目] 国家自然科学基金（81360056）；广西自然科学基金面上项目（2013GXNSFAA019147）；广西自然科学基金回国基金项目（2012GXNSFCA053005）；广西研讨生教育立异方案项目（YCSZ2012032）；广西医科大学“未来学术之星”大学生课外科研课题项目
[作者简介] 陈永畅（1985-），女，原籍：广西桂林，广西医科大学2011级硕士研讨生，首要从事神经药理学研讨
▲通讯作者：何萍（1975-），女，原籍：湖南岳阳，教授，硕士生导师，首要从事神经药理学研讨
