梁俊君 王亚冰 辛海边
[摘要]意图 探討重组人促红细胞生成素rhEPO是否经过JAK2/STAT5信号通路削减脑出血后神经细胞的凋亡。办法 将8周龄的Wistar雄性大鼠30只随机分3组：假手术组、ICH模型组、rhEPO组，每组10只。ICH模型组大鼠进行ICH造模，假手术组除不注血外，其他进程同ICH模型组，rhEPO组术后5 min给予腹腔打针rhEPO，一切动物24 h后进行神经功用学评分，搜集大鼠脑安排，运用原位缺口末端符号法检测神经细胞凋亡的改变；选用免疫安排化学SP法检测凋亡蛋白Caspase3表达；并选用Real-time PCR和Western blot检测磷酸化JAK2、磷酸化STAT5基因和蛋白表达状况。成果 手术树立脑出血模型后24 h进行神经功用评分。按 Longa5分制规范断定，ICH 组4只点评为1分，3只点评为2分，2只点评为3分；rhEPO组医治后，5只点评为1分，2只点评为2分，1只点评为3分，阐明rhEPO能够改进大鼠脑出血后神经元损害，康复神经功用。与假手术组比较，ICH模型组和rhEPO组中神经元凋亡细胞及Caspase3的蛋白表达阳性细胞数显着增多（P<0.05），而rhEPO组中凋亡细胞与ICH模型组比较显着削减（P<0.05）；与假手术组比较，ICH模型组和rhEPO组中JAK2和STAT5的蛋白表达和mRNA表达显着上升（P<0.05），与ICH模型组比较，rhEPO组中JAK2和STAT5的蛋白表达和mRNA表达显着下降，差异均有统计学含义（P<0.05）。定论 外源性rhEPO能够经过调理JAK2/STAT5信号改进大鼠脑出血后神经元损害，关于神经系统具有维护效果。
[关键词]rhEPO；脑出血；神经维护；JAK2/STAT5 信号通路
[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）06（a）-0008-05
[Abstract]Objective To investigate whether recombinant human erythropoietin （rhEPO） could decrease neuron apoptosis after cerebral hemorrhage by regulating JAK2/STAT5 signaling pathway.Methods 30 Wistar male rats of 8 weeks old were randomly divided into 3 groups：sham operation group，ICH model group and rhEPO group，the rats in ICH model group were treated with ICH.In the sham operation group，the treatment were same as ICH group except blood injection.rhEPO group was injected with rhEPO at 5 min after operation.All animals were scored with neurological score at 24 h after the ICH model was established.The effect of neuronal apoptosis were detected by TUNEL staining.The expression of pro-apoptosis protein Caspase3 was detected by immunohistochemistry.The expressions of JAK2 and STAT5 mRNA and protein were measured by Real time PCR and Western blot.Results Neurological score was performed 24 hours after the establishment of the intracerebral hemorrhage model.According to the criteria of Longa5 standard，in ICH group，four rats were evaluated as score 1，three rats were rated as score 2 and two rats were rated as score 3.In rhEPO group，five rats were evaluated as score 1 and two rats were rated as score 2，one rat were rated at score 3，indicating that rhEPO can ameliorate neuronal damage and restore nerve function after intracerebral hemorrhage in rats.Compared to sham group，the quantity of apoptotic cells and the expression of Caspase3 in ICH model group and rhEPO group were significantly increased （P<0.05），while the apoptotic cells in rhEPO group were significantly down-regulation compared with the ICH group （P<0.05）.Compared with the sham group，the protein expression and mRNA expression of JAK2 and STAT5 in ICH group and rhEPO group were significantly up-regulated （P<0.05），while the protein expression and mRNA expression of JAK2 and STAT5 in rhEPO group were decreased significantly compared to ICH group （P<0.05）.Conclusion rhEPO reduce neuronal apoptosis by regulating JAK2/STAT5 signal after cerebral hemorrhage，and has protective effect on the nervous system in rats .
[Key words]rhEPO；Intracerebral hemorrhage；Neuroprotection；JAK2/STAT5 signal pathway
脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是腦卒中中的第二大类疾病，脑卒中患者中15%的患者是脑出血疾病[1]。脑出血特点是发展较快、高致残率和高逝世率[2]。据报导，脑出血病号的逝世率高达40%，脑出血后细胞的逝世会形成脑出血后对脑的二次损害[1]。促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是调理血细胞生成的一种细胞因子，之前的研讨报导标明EPO对脑以及身体其他器官有维护效果。EPO对试验性的脑梗死、缺血再灌注损害均有维护效果[3-4]。EPO能够经过磷酸化激活AKT信号通路进步脑损害后神经细胞的生存率[5]，但关于EPO是否能够维护脑出血后神经细胞以及相应的机制研讨较少。本试验旨在评论外源性rhEPO关于神经系统的维护效果，选用大鼠脑出血ICH模型，调查重组人红细胞生成素（rhEPO）对大鼠脑ICH模型医治后，对神经细胞凋亡以及凋亡相关蛋白Caspase3表达的影响，并评论相关效果机制。
1 材料与办法
1.1首要试剂与仪器
重组人促红细胞生成素购自上海索宝生物科技有限公司；实时荧光定量PCR仪-7500购自美国Thermo Fisher公司；电泳设备购自Major Science；多克隆Caspase3、JAK2、STAT5一抗购自美国abcam试剂公司；碱性磷酸酶符号山羊抗兔IgG二抗购自上海安驰生物科技有限公司； DAB显色试剂盒和TUNEL凋亡试验盒购自上海索宝生物科技有限公司；蛋白浓度测定运用BCA试剂盒购自碧云天生物技能有限公司。
1.2试验动物与分组处理
8周龄SPF级雄性Wistar大鼠30只（购买于北京维通利华试验动物技能有限公司）。大鼠养殖在SPF级动物试验室，温度为（22±2）℃， 12 h/12 h昼夜循环光照。大鼠构建脑出血ICH模型后随机分为3组：假手术组、ICH模型组和rhEPO组，每组10只。
1.3办法
1.3.1 ICH模型的制备 腹腔打针10%的水合氯醛（0.35 ml/100 g）麻醉大鼠，将大鼠固定于脑立体定位仪上，消毒切开头皮，微量打针仪取大鼠自体不凝血50 μl，然后匀速缓慢2～3 min注入右侧大鼠尾状核部位，留针10 min再缓慢拔出，缝合切断。医治组术后腹腔打针rhEPO（3000 IU/kg），假手术组进程同上，仅不打针血。假手术组与ICH模型组术后腹腔打针0.5 ml生理盐水。
1.3.2脑标本收集与安排切片制备 大鼠用10%水合氯醛（0.35 ml/100 g）腹腔打针麻醉后，顺次用4℃生理盐水400 ml，4%多聚甲醛400 ml进行心脏灌注。取脑后用4%多聚甲醛固定48 h后，惯例脱水、通明及浸蜡包埋，制备厚度为5 μm的白腊切片，别离用于免疫安排化学染色及TUNEL凋亡检测。
1.3.3神经功用评分 手术后功用残缺按 Longa5分制规范进行评分。0分：无显着神经病学症状；1分：不能彻底扩展左前肢；2分：向左边旋转；3分：行走时向左边倾倒；4分：不能自行行走， 有意识妨碍。ICH造模后24 h检测动物的神经功用评分。
1.3.4 TUNEL原位凋亡细胞检测 3%浓度 H2O2室温孵育白腊切片10 min，37℃下用蛋白酶K消化10 min。37℃参加符号液孵育2 h，室温加关闭液孵育30 min。参加生物素化抗地高辛抗体室温孵育30 min，SABC试剂参加其间恒温37℃反响30 min，DAB显色液参加其间进行显色，用显微镜进行调查。凋亡阳性细胞为细胞核含有棕黄色颗粒者，每张切片计数5个视界，核算切片凋亡细胞数。
1.3.5 免疫安排化学法检测Caspase3表达 PBS洗刷切片3次，室温下滴入血清进行关闭30 min，然后滤纸汲取残留的血清，参加一抗Caspase3（1∶500）孵育过夜，隔夜复温45 min，PBS洗刷3次，二抗（1∶1000）孵育30 min，PBS洗刷三次，参加SP室温反响30 min，参加DAB显色液。显微镜调查。细胞核中含有棕黄色颗粒为阳性，取5个视界，核算切片中的表达Caspase3的阳性细胞数目。
1.3.6 Western blot检测磷酸化JAK2、STAT5的表达量 依照100∶1的份额混合裂解液与PMSF，裂解液裂解大脑安排后，低温离心10 min，转速为12 000 r/min，用BCA试剂盒测定总蛋白浓度，调整各组的蛋白总量为30 μg/μl。取各组样品参加电泳槽中进行电泳，底层胶20 min、80V，别离胶60 min、120 V，按蛋白分子量巨细切胶，转膜，用BSA关闭PVDF膜1 h，参加一抗（1∶500），4℃孵育过夜，隔夜室温下用TBST洗膜3次，参加二抗（1∶1000），孵育1 h，用TBST洗膜3次，参加显色液进行显色3 min，用Quantity-one软件以及Bio-Pro凝胶成像剖析仪成像对各条带进行灰度扫描然后得出相应蛋白表达量。
1.3.7 Real-Time PCR检测大鼠JAK2、STAT5 mRNA表达含量 用Trizol提取中脑安排RNA，用Prime ScriptRRT试剂盒逆转录组成cDNA （购自TaKaRa公司），用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒进行Real-time PCR操作（购自TaKaRa），其引物序列为：JAK2——F：5′-GCTCCTCTCCTTGACGACTTT-3′，R：5′-ACCTTATCCGCTTCCGAGTTA-3′；STAT5——F：5′-GGGC-ATCACCATTGCTTGGAAG-3′，R：5′-GGAGCTTCTGGCAGAAGTGAAG-3′；Β-ACTIN——F：5′-TGGGT-CAGAAGGACTCCTATG-3′，R：5′-CAGGCAGCTCATA-GCTCTTCT-3′。
PCR反响取得阈值循环数（cycle threshold，CT），然后采纳CT值比较法，即运用开始cDNA浓度的对数与CT值成反比联系，然后核算出不同样本之间的相对百分数。公式为 ΔΔCT=（CT.试验组意图基因-CT.试验组管家基因）-（CT.对照组意图基因-CT.对照组管家基因）。意图基因的mRNA的量=2-ΔΔCT。
1.4统计学处理
数据运用统计剖析软件SPSS 13.0进行处理，计量材料用x±s标明，组间比较选用单因素方差剖析，以 P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1各组的神经功用评分
如表1所示，手术树立脑出血模型后24 h进行神经功用评分。按 Longa5分制规范断定，ICH 模型组4只点评为1分，3只点评为2分，2只点评为3分；rhEPO组医治后，5只点评为1分，2只点评为2分，1只点评为3分，阐明rhEPO能够改进大鼠脑出血后神经元损害，康复神经功用。
2.2 TUNEL凋亡检测成果
如图1所示，假手术组只是见到极少量凋亡细胞，ICH模型组和rhEPO组凋亡细胞显着增多。图2标明TUNEL原位凋亡细胞检测凋亡细胞数的改变，与假手术组比较，ICH模型组和rhEPO组中凋亡细胞显着增多（P<0.05）；与ICH模型组比较，rhEPO组中凋亡细胞显着削减，差异有统计学含义（P<0.05）。
2.3 Caspase3免疫安排化学成果
由图3可知，假手术组、ICH模型组和rhEPO组的Caspase3蛋白的染色强度差异有统计学含义（P<0.05）。如图4，免疫安排化学的光密度成果剖析显现，ICH模型组和rhEPO组中的Caspase3蛋白表达含量均比假手术组中的蛋白表达有显着添加（P<0.05）。与ICH模型组中的Caspase3蛋白表达含量比较，rhEPO组中的Caspase3表达含量显着下降（P<0.05）。
2.4 JAK2、STAT5蛋白表达水平
如图5，与假手术组比较，ICH模型组和rhEPO组中JAK2、STAT5的蛋白表达量显着增高，差异有统计学含义（P<0.05）；与ICH模型组比较，rhEPO组中的JAK2、STAT5蛋白表达量显着下降，差异有统计学含义（P<0.05），阐明rhEPO组能够调理JAK2/STAT5信号通路的蛋白水平改进大鼠脑出血后神经元损害。
2.5 JAK2、STAT5 mRNA表达水平
如图6，与假手术组比较，ICH模型组和rhEPO组中JAK2、STAT5的mRNA表达量显着增高，差异有统计学含义（P<0.05）；与ICH模型组比较，rhEPO组中的JAK2、STAT5 mRNA表达量显着下降，差异有统计学含义（P<0.05），阐明rhEPO组能够调理JAK2/STAT5信号通路的基因水平来缓解大鼠脑出血后神经元损害。
3 评论
跟着人群年纪的增加，脑出血的发作率显着升高，致残致死率高[6]。脑出血后原发性的脑损害首要是因为脑血肿关于附近脑安排的损害，脑出血后继发性的损害也是脑出血后患者神经功用的损害的重要原因[7]。继发性的脑损害原因包含细胞逝世、脑水肿、血脑屏障的损坏，相关机制包含炎症反响、细胞毒性、细胞凋亡后开释的物质、酶活性的按捺等[8]。脑出血后各种酶的改变也会导致细胞的凋亡[7，9-10]，因而，按捺细胞凋亡、维护神经细胞是医治脑血管病的重要根底。EPO是一种存在于人体内的一种糖蛋白，具有进步造血的功用。最近研讨标明，EPO能够促进神经系统再生以及按捺细胞凋亡、进步细胞生存率[11]。之前有报导称，EPO能够经过磷酸化激活AKT促进神经细胞的存活。有研讨标明，EPO及促红细胞生成素受体在脑安排中均有表达[12]，而且rhEPO预处理对体外培育的神经细胞有显着的维护效果，EPO具有维护神经细胞的效果[13-14]。作为一个最新的维护因子，其维护效果及其机制引起很多的研讨。可是EPO在脑出血中的效果及其相关机制研讨较少[15]。
脑出血之后血肿周围的细胞会呈现凋亡[16]。其间信号通路是多种细胞因子和生长因子等的一起通路[17]，应激反响时，JAK2/STAT5 的信号传导能够与胞膜上的 JAK 结合位点，并促进 STAT磷酸化，完结与意图基因的信号传导和表达调控[18]。JAK-STAT在细胞的凋亡、分解、增殖以及各种中枢神经系统疾病中具有重要效果[19-20]。
本研讨結果显现，凋亡细胞数和Caspase3的蛋白表达阳性细胞数在ICH模型组和rhEPO组中显着增多，阐明在ICH模型组和rhEPO组中，脑出血模型树立成功，而且神经元损害较多，细胞凋亡发作显着。但与ICH模型组比较，rhEPO组中凋亡细胞和Caspase3的蛋白表达阳性细胞数显着削减，阐明rhEPO具有神经维护效果，能够发作抗细胞凋亡的效果。ICH模型组和rhEPO组中JAK2、STAT5的蛋白和mRNA表达量显着增高，阐明脑出血进程中JAK2/STAT5信号通路参加了神经损害进程；而与ICH模型组比较，rhEPO组中的JAK2、STAT5蛋白和mRNA表达量显着下降，阐明rhEPO组能够调理JAK2/STAT5信号通路的蛋白和mRNA水平改进大鼠脑出血后神经元损害。本试验成果阐明JAK2、STAT5的显着性表达参加了脑出血ICH发作的重要阶段，能够经过促进细胞凋亡进程导致神经细胞损害。而rhEPO能够经过调理JAK2/STAT5信号通路来缓解神经细胞损害，在神经细胞维护抗凋亡进程中起重要效果。
综上所述，rhEPO的神经维护效果机制可能是JAK2/STAT5信号机制通路所介导的抗凋亡的效果。研讨rhEPO在脑出血发作后发作维护效果的详细机制，对削减脑出血后削减细胞凋亡，维护神经细胞，促进神经功用的康复有着重要含义，能够为临床医治供给有用的协助。
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（收稿日期：2017-03-17 本文編辑：许俊琴）
