张鹏 纪亮 沈雷 王玉 李萌 刘琰
[摘要] 意图 调查高糖环境下，锰超氧化物歧化酶（MnSOD）影响间充质干细胞（MSC）上清液对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）增殖和趋化才能的影响。 办法 高糖MSC培育基条件下，100μg/L MnSOD影响的MSC为试验组，未影响的MSC为对照组，增加Akt阻断剂5μmol/L Tricirlbine为Akt阻断剂组，运用各组条件培育基在高糖1640培育基条件下，培育人脐静脉内皮细胞（HUVEC），运用MTT法调查各条件培育基对HUVEC增殖的影响，并运用细胞划痕试验和Transwell细胞搬迁试验对HUVEC的趋化状况进行评价。 成果 与对照组比较，MSC试验组条件培育基促进HUVEC增殖；可是Akt阻断剂组HUVEC增殖才能下降；MSC试验组条件培育基效果的HUVEC趋化活动与对照组比较显着提高，但MSC试验组HUVEC趋化活动在Akt阻断剂组显着被按捺；MSC试验组条件培育基中VEGF含量比对照组显着提高。定论 高糖条件下MnSOD能够经过影响间充质干细胞旁排泄VEGF等细胞因子对血管内皮细胞增殖、趋化等才能发作影响。
[关键词] 间充质干细胞；锰超氧化物歧化酶；旁排泄；人脐静脉血管内皮细胞
[中图分类号] R329.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）13-0013-03
全球糖尿病患者到2035年将增加5.92亿[1]。高血糖增加活性氧，致使皮肤血管内皮细胞代谢紊乱 [2]。MSC移植到糖尿病足创伤，能够加快创伤愈合[3]，MnSOD在对立活性氧的过程中发挥重要效果，假如运用MnSOD发挥对MSC的抗高糖损害效果，将到达促进溃疡区血管重生之意图，促进MSC细胞疗法的广泛临床运用具有重要含义[4]。
1 材料与办法
1.1 细胞培育和分组
人骨髓间充质干细胞（MSC）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）别离在正常或高糖MSC培育基中培育MSC为对照组，或增加100mmol/L MnSOD为试验组（MnSOD-MSC），增加5μmol/l Tricirlbine为Akt阻断剂组。
提取各组细胞上清液为条件培育基（conditioned medium， CM），别离为MSC对照组、MnSOD-MSC组、Akt阻断剂组条件培育基。人脐静脉内皮细胞（HUVEC）试验分组按条件培育基而定。
1.2 条件培育基中VEGF、GSHPX、SOD检测
搜集各组MSC条件培育基，运用英国Randox公司出产的ELISA试剂盒测定SOD、GSHPX和VEGF的含量。
1.3 细胞划痕试验
HUVEC接种于6孔板，0.1%FBS的RPMI-1640培育基培育24h，1000μL枪头划痕，并增加2mM羟基脲（Sigma），培育24h，选用IPP软件核算划痕面积闭合率。
1.4 Transwell细胞搬迁试验
HUVEC用0.1%FBS的RPMI-1640培育基培育24h，以8×103个细胞/孔接种，放置在Transwell细胞小室内，孵箱6h，核算染色的细胞数目（100×）。
1.5 统计学剖析
统计学处理选用SPSS18.0软件包，计量材料以（x±s）表明，选用t查验，P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 间充质干细胞在高糖环境下的增殖
正常MSC对照组的OD值为（0.913±0.344），高糖条件下，MSC对照组、MnSOD-MSC组和Akt阻断剂组的OD值别离为（0.425±0.147）、（1.261±0.579）和（0.635±0.812）。其间正常MSC对照组与高糖条件下MSC对照组、高糖条件下MSC对照组和MnSOD-MSC组、高糖条件下MnSOD-MSC组和Akt阻断剂组OD值比较，差异均有统计学含义（P<0.01）。
2.2各组CM对HUVEC增殖影响
高糖条件下，MSC对照组、MnSOD-MSC组和Akt阻断剂组CM对HUVEC增殖的OD值别离为（0.824±0.176）、（1.590±0.152）和（1.073±0.294），其间前两组和后两组别离比较，差异均有统计学含义（P<0.01）。
2.3 各组CM对HUVEC趋化才能的效果
MnSOD-MSC CM组和MSC CM组HUVEC划痕闭合面积别离为（0.26±0.15）μm2、（0.19±0.03）μm2，两者具有显着差异（P<0.01），见图1A、B、G；Akt阻断剂CM组HUVEC划痕闭合面积为（0.17±0.51）cm2，与MnSOD-MSC CM组比较具有显着差异（P<0.01），见图1B、C、G。
MnSOD-MSC CM组和MSC CM组HUVEC搬迁数目别离为（1824.85±10.11）、（928. 64±13.24），两者具有显着差异（P<0.01），见图1D、E、H；Akt阻断剂CM组HUVEC搬迁数目为（1121.50±21.67），与MnSOD-MSC CM组比较有显着差异（P<0.01），见图1E、F、H。
图1 HUVEC划痕和搬迁成果
A-C：各组HUVEC细胞划痕图（40×），图框代表0h划痕面积；D-F：各组CM组HUVEC细胞搬迁图（100×）；G：HUVEC划痕统计图，*P<0.01；H：HUVEC搬迁统计图，*P<0.01
2.4 各组CM中细胞因子的检测
各组条件培育基中VEGF、GSHPX、SOD的检测，见表1。
表1 各组条件培育基中VEGF、GSHPX、SOD含量（ng/L，n=9，x±s）
3 评论
血管发作的有关细胞因子和生长因子密切配合，和谐一致地参加调理血管生成[5]。糖尿病足首要病理变化为部分微血管、神经的病理变化，并发作很多自由基[2]。糖尿病小鼠皮肤MnSOD等抗氧化酶活性显着下降[5]。尽管MSC有正常抗氧化酶系统，可是糖尿病时的MSC细胞活性下降，其排泄的MnSOD等抗自由基酶类下降，影响MSC生物效果[6]。MnSOD基因转染本身骨髓干细胞能够重建损害性食管炎内膜修正[7]，提示该基因修饰的MSC能够归巢到糖尿病创伤，加快创伤愈合[8]。
本试验成果表明，高血糖条件下，MnSOD能够促进MSC增殖，发挥了MnSOD的抗自由基维护细胞的效果，抗高糖效果十分显着。MnSOD影响的MSC改进血管内皮细胞活性，促进血管内皮细胞增殖，并发挥了促进HUVEC搬迁等才能，MnSOD影响的MSC条件培育基中VEGF、SOD等血管活化因子或抗自由基蛋白表达升高，其机制可能是因为在MnSOD的影响下，经过Akt途径活化MSC，促进MSC旁排泄VEGF、SOD等细胞因子，排泄的SOD等物质维护血管内皮细胞对立高血糖环境，而发作的VEGF等因子则对血管内皮细胞具有促进成血管的才能，假如将MnSOD影响的MSC移植到糖尿病足皮肤区域，能够发挥对立自由基、维护细胞、促进血管重生的重要功用，将显着加快创伤愈合，后续研讨咱们将会用MnSOD转染的MSC运用于体内糖尿病动物足试验模型，调查MnSOD-MSC对糖尿病足愈合的效果和机制，为MSC临床运用供给研讨根底和材料。
[参考文献]
[1] L. Guariguata， DR. Whitingb， I. Hambletonc，et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035 for the IDF Diabetes Atlas[J]. Diabetes Research and Clinical Practice，2013， 27（11）：1345-1352.
[2] Gray SP， Di ME， Okabe J， et al. NADPH oxidase 1 plays a key role in diabetes mellitus-accelerated atherosclerosis[J]. Circulation， 2013，127（18）：1888-1902.
[3] Hodgkinson CP， Gomez JA， Mirotsou M， et al. Genetic engineering of mesenchymal stem cells and its application in human disease therapy[J]. Hum Gene Ther， 2010，21（11）：1513-1526.
[4] He T， Peterson TE， Holmuhamedov EL， et al. Human endothelial progenitor cells tolerate oxidative stress due to intrinsically high expression of manganese superoxide dismutase[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24（11）：2021-2027.
[5] Marrotte EJ， Chen DD， Hakim JS， et al. Manganese superoxide dismutase expression in endothelial progenitor cells accelerates wound healing in diabetic mice[J]. J Clin Invest，2010，120（12）：4207-4219.
[6] Cho KA， Woo SY， Seoh JY， et al. Mesenchymal stem cells restore CCl4-induced liver injury by an antioxidative process[J]. Cell Biol Int， 2012，36（12）：1267-1274.
[7] Niu Y， Epperly MW， Shen H， et al. Intraesophageal MnSOD-plasmid liposome enhances engraftment and self-renewal of bone marrow derived progenitors of esophageal squamous epithelium[J]. Gene Ther， 2008，15（5）：347-356.
[8] Volarevic V， Arsenijevic N， Lukic ML， et al. Concise review： Mesenchymal stem cell treatment of the complications of diabetes mellitus[J]. Stem Cells， 2011，29（1）：5-10.
（收稿日期：2014-02-26）
血管发作的有关细胞因子和生长因子密切配合，和谐一致地参加调理血管生成[5]。糖尿病足首要病理变化为部分微血管、神经的病理变化，并发作很多自由基[2]。糖尿病小鼠皮肤MnSOD等抗氧化酶活性显着下降[5]。尽管MSC有正常抗氧化酶系统，可是糖尿病时的MSC细胞活性下降，其排泄的MnSOD等抗自由基酶类下降，影响MSC生物效果[6]。MnSOD基因转染本身骨髓干细胞能够重建损害性食管炎内膜修正[7]，提示该基因修饰的MSC能够归巢到糖尿病创伤，加快创伤愈合[8]。
本试验成果表明，高血糖条件下，MnSOD能够促进MSC增殖，发挥了MnSOD的抗自由基维护细胞的效果，抗高糖效果十分显着。MnSOD影响的MSC改进血管内皮细胞活性，促进血管内皮细胞增殖，并发挥了促进HUVEC搬迁等才能，MnSOD影响的MSC条件培育基中VEGF、SOD等血管活化因子或抗自由基蛋白表达升高，其机制可能是因为在MnSOD的影响下，经过Akt途径活化MSC，促进MSC旁排泄VEGF、SOD等细胞因子，排泄的SOD等物质维护血管内皮细胞对立高血糖环境，而发作的VEGF等因子则对血管内皮细胞具有促进成血管的才能，假如将MnSOD影响的MSC移植到糖尿病足皮肤区域，能够发挥对立自由基、维护细胞、促进血管重生的重要功用，将显着加快创伤愈合，后续研讨咱们将会用MnSOD转染的MSC运用于体内糖尿病动物足试验模型，调查MnSOD-MSC对糖尿病足愈合的效果和机制，为MSC临床运用供给研讨根底和材料。
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[7] Niu Y， Epperly MW， Shen H， et al. Intraesophageal MnSOD-plasmid liposome enhances engraftment and self-renewal of bone marrow derived progenitors of esophageal squamous epithelium[J]. Gene Ther， 2008，15（5）：347-356.
[8] Volarevic V， Arsenijevic N， Lukic ML， et al. Concise review： Mesenchymal stem cell treatment of the complications of diabetes mellitus[J]. Stem Cells， 2011，29（1）：5-10.
（收稿日期：2014-02-26）
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[5] Marrotte EJ， Chen DD， Hakim JS， et al. Manganese superoxide dismutase expression in endothelial progenitor cells accelerates wound healing in diabetic mice[J]. J Clin Invest，2010，120（12）：4207-4219.
[6] Cho KA， Woo SY， Seoh JY， et al. Mesenchymal stem cells restore CCl4-induced liver injury by an antioxidative process[J]. Cell Biol Int， 2012，36（12）：1267-1274.
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[8] Volarevic V， Arsenijevic N， Lukic ML， et al. Concise review： Mesenchymal stem cell treatment of the complications of diabetes mellitus[J]. Stem Cells， 2011，29（1）：5-10.
（收稿日期：2014-02-26）
