张晓东+姚芳
[摘要]意图 经过高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS/MS）树立结核性脑膜炎患者脑脊液中利福霉素钠的测定办法。办法 选用XTerraRMS C18色谱柱（4.6 mm×100.0 mm，3.5 μm），以醋酸铵（0.01 mol/L）-甲醇（10∶90）为活动相，流速为0.4 ml/min。经HPLC别离，以多反响监测（MRM）测定。成果 本办法在0.4～4.0 μg/ml浓度范围内线性杰出（r=0.9997）；检出限为100 ng/ml。定论 本办法操作简略，成果精确，可用于结核患者脑脊液中利福霉素钠含量测定。
[关键词]高效液相色谱-质谱联用；结核性脑膜炎；脑脊液；利福霉素钠
[中图分类号] R969 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）02（b）-0012-03
[Abstract]Objective To establish a method for determination Rifamycin sodium in the cerebrospinal fluid of patients with tuberculous meningitis by HPLC-MS/MS.Methods Column was XTerraRMS C18（4.6 mm×100.0 mm，3.5 μm）.Mobile phase was Ammonium acetate （0.01 mol/L）-Methanol（10：90）.Flow rate was 0.4 ml/min.Multiple reaction monitoring（MRM） was used by HPLC.Results The linear ranges of 0.4-4.0 μg/ml （r=0.9997） was better；Detection limit was 100 ng/ml.Conclusion The method is simple，rapid，accurate，and it can be used for therapeutic drug monitoring.
[Key words]HPLC-MS/MS；Tuberculous meningitis；Cerebrospinal fluid；Rifamycin sodium
结核病，又称痨病，是一种陈旧的盛行症，它曾在世界范围广泛盛行，并攫取数亿人的生命。自1944年发现链霉素对结核分枝杆菌有用及1962年利福霉素使用于临床以来，异烟肼等很多抗结核药物的呈现，创始了以利福霉素、利福平、异烟肼为主的结核化疗年代，并使盛行得到了必定的操控。结核性脑膜炎（tubercular meningitis，TBM）是因为结核分枝杆菌感染所造成的的中枢神经系统感染性疾病，是结核病中最严峻的一种，若医治不及时，可导致严峻的神经系统并发症，终究引起患者逝世或留传严峻后遗症[1]。
医治药物监测（therapeutic drug monitoring，TDM）是使用现代剖析技能测定患者体液中的药物及其代谢产品浓度，以优化规划或调整给药方案，以完成个体化医治，进步作用，减免毒副作用的药学技能办法[2]。TDM是近代临床药物医治划年代的重大进展之一，也是结核化疗中的一个新的发展方向。血药浓度监测仅仅TDM的一个重要组成部分。本课题拟树立测定抗结核药物利福霉素在TBM患者脑脊液中浓度的办法并进行剖析，制定合理的给药方案，以防止药物过量引起的不良反响及药物缺乏导致的医治失利，也为往后其他项目（尿药浓度、痰药浓度、胸腹水药物浓度等）的TDM作业供给根据。
1仪器与资料
质谱仪：美国AB公司API3200LC-MS/MS质谱仪；液相色谱仪：日本岛津公司LC-20A型高效液相色谱仪，大气压化学电离源[3]；活动相为醋酸铵（0.01 mol/L）-甲醇（10∶90），醋酸铵、甲醇为色谱纯，利福霉素鈉为标准品。
2办法与成果
2.1剖析条件
2.1.1液相色谱条件 色谱柱：沃特世公司C18柱，标准：4.6 mm×100.0 mm，3.5 μm；活动相：0.01 mol/L的醋酸铵-甲醇（10∶90）；流速：0.4 ml/min；柱温：室温。
2.1.2质谱条件 减簇电压（DP）：95 V；磕碰室进口电压（CEP）：20 V；Q1进口电压（EP）：8.0 V；磕碰室出口电压（CXP）：20 V；离子源电压（IS）：5500 V；磕碰电压（CAD）：8.0 V；离子源：APCI，ESI；扫描办法：正离子扫描；温度（TEM）：500℃；气帘气（CUR）：20 psi；GS1：50 psi；GS2：50 psi；MRM：719.9/688.2，CE：35 V；MRM：719.9/660.1，CE：40 V；MRM：719.9/295.0，CE：62 V[4-6]。
2.2溶液制备
2.2.1利福霉素钠标准储藏液制备 称取利福霉素钠对照品0.010 03 g，置100 ml量瓶中，配制为100.3 μg/ml的溶液。
2.2.2利福霉素钠作业溶液制备 取利福霉素钠标准储藏液， 置10 ml量瓶中，加甲醇-水（50∶50）溶液稀释至刻度，摇匀，得10.03 μg/ml的作业溶液。取10.03 μg/ml的利福霉素钠作业溶液1 ml置100 ml量瓶中，加甲醇-水（50∶50）溶液稀释至刻度，摇匀，得100.3 ng/ml的作业溶液。
2.3样品的来历和制备
2.3.1样品的来历 TBM患者脑脊液：2016年1～6月在内蒙古第四医院住院的TBM患者，住院期间行腰椎穿刺术取脑脊液。
2.3.2样品的制备 取患者脑脊液1 ml置15 ml塑料离心管中，精细加甲醇-水溶液（50∶50）4 ml，涡旋3 min，溶液经微孔滤膜（0.45 μm）过滤后，供液相色谱串联质谱仪测定[7]。
2.4 LC-MS/MS的条件
2.4.1 LC-MS/MS的条件挑选 挑选不同的液相色谱柱及色谱、质谱条件[8-11]，最终确定为“2.1”项下的液相色谱串联质谱条件检测利福霉素钠，使用“2.1”项下的色谱-质谱条件进行剖析。
2.4.2标准曲线 取2 μg/ml的标准溶液，别离进样1、2、4、5、6、8、10 μl，用“2.1”项下的LC-MS/MS条件进行测定，得到定量离子对719.9/688.2的峰面积。以测定浓度（X，μg/ml）为横坐标与峰面积（Y，counts）为纵坐标进行线性回归剖析，线性方程为Y=5.22e+004X-1.52e+003（r=0.9997）。成果见表1、图1，提示利福霉素钠在0.4～4.0 μg/ml范围内线性联系杰出。
2.4.3检测限 将100 ng/ml的利福霉素钠作业溶液进样5 μl，得信噪比S/N=3.6，该办法的检出限为100 ng/ml。
2.4.4精细度实验 将利福霉素钠制成0.4 g/ml的标准溶液6份，别离经过“2.1”项下的办法检测，得到的峰面积别离为19 754、18 965、20 038、18 997、19 765、18 661（RSD=2.9%），办法精细度较好。
2.4.5安稳性实验 将0.8 μg/ml的利福霉素钠标准溶液别离于0、1、4、8、12、24 h别离进样5 μl。选用上述液相色谱串联质谱条件进行剖析，得到峰面积别离为38 970、41 120、40 665、38 385、38 100、36 919（RSD=4.1%），显现利福霉素钠在24 h内安稳。
2.4.6实践样品的测定实验 以时刻（min）为横坐标，以呼应浓度（cps）为纵坐标，别离做阴性对照色谱图及利福霉素钠对照品色谱图，别离见图2、3，使用本办法测定6例不同TBM患者脑脊液中利福霉素钠的量别离为0.51、0.43、0.40、0.68、0.35、0.28 μg/ml。
3评论
利福霉素为半组成的广谱抗菌素，它对分枝杆菌，特别是对结核菌有强力的抑菌作用。利福霉素行静脉注射或部分使用作用较好，口服简直不能到达有用的血药浓度；药代动力学方面，单次静脉滴注利福霉素钠0.5、1.0、2.0 g后的血药峰浓度（Cmax）别离为28、46、90 mg/L，1 h后即下降至50%左右。每6小时静注利福霉素钠0.5 g，稳态血药浓度为36 mg/L。血浆蛋白结合率<5%。血液消除半衰期（t1/2）为3～5 h[12]。该药在脑脊液中的散布状况及浓度罕见具体报导，期望经过该项研讨，补偿脑脊液中利福平、利福霉素药物浓度测定的缺乏，为进一步研讨血液、脑脊液中药物代谢状况供给技能支持[13]。
一起，利福霉素的灭菌才能与药物在病灶区域的浓度有密切联系，但其具有肝脏毒性、胃肠功能紊乱、神经系统症状、血小板削减症和变态反响等严峻的毒副作用[14]。因而，本课题经过监测生物体液中药物的浓度，以到达最佳医治作用，并尽量削减毒副作用，具有重要的临床意义。
液质联用技能在剖析药物及其在各种杂乱生物基质（全血、血浆、尿、胆汁及生物安排）中的代谢产品时，因为其挑选性强、活络度高，不只能够防止杂乱、繁琐、耗时的样品前处理作业，并且能别离判定以往难于辨识的痕量药物代谢产品，尤其是串联质谱（MS/MS）的使用，经过多反响监测（MRM），能够大大进步剖析的专一性，改进信噪比，进步活络度，然后快速、方便地解决问题[15]。
本研讨选用液质联用的办法对TBM患者脑脊液中利福霉素进行检测，具有办法活络、精确、安稳性好等长处。脑脊液中药物浓度监测仅仅TDM中的一个重要组成部分。本课题经过树立结核药物监测的办法并进行药动学剖析，以制定合理的给药方案，为往后其他药物医治学监测作业供给根据。
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（收稿日期：2016-12-23 本文修改：方菊花）
[基金项目]内蒙古自治区医疗卫生计生科研方案项目（2013 03027）
