张丹妍 杨玉有 杨智曦 李重生 吕静 马明福 李练兵
【摘要】意图 查询和剖析22个STR基因座（AGCU身份判定系统的EX22试剂盒）在重庆汉族人群亲子判定中的骤变现象，探究STR基因座的骤变规则。办法 选用AGCU EX22试剂盒对1596例支撑存在亲权联系的事例（三联体563例，二联体1033例）筛查出含等位基因骤变事情，核算各STR基因座的骤变率、骤变等位基因的来历、骤变步数及重复单位添加或削减状况，剖析骤变相关要素的特色。成果 22个被检测的STR基因座中有20个座查询到骤变，共查询到53次骤变，其间一步骤变49次（3.08%），二步骤变1次（0.06%），三步骤变3次（0.19%），D2S441和TPOX点位未查询到骤变。各基因座的骤变率介于0.05%～0.42%，均匀骤变率约0.1289%。来历于父系的骤变与来历母系的骤变份额约16.67：1，具有核算学差异（P<0.001）。添加重复单位和削减重复单位的骤变事情比值为1.5：1。定论 STR基因座骤变是亲子判定中较为常见的现象，当呈现1或2个基因座不契合遗传学的规则时，需求加测其他检测系统，并核算骤变基因座PI值及所检测的基因座的累计父权指数值，用于清晰判定定见。别的应不断堆集STR基因座骤变数据，挑选契合重庆人群的遗传特色及具有高鉴别能力的STR基因座的遗传符号，以确保判定成果的精确牢靠。
【关键词】法医遗传学；短串联重复序列；亲子判定；DNA骤变剖析
【中图分类号】R450 【文献标识码】B 【文章编号】ISSN.2095-6681.2018.15..03
短串联重复序列（short tandem repeats，STR）遍及存在于人类基因组中，是具有多态性的一类DNA序列。STR一般由2～6 bp中心序列串联重复而成，重复次数从几回到几十次不等[1-2]。STR具有品种多、散布广、多态性高、扩增成功率高、检测活络、重复性好、高杂合度、简单检测并遵从孟德尔共显性遗传规则等特色，在法医学亲子判定、个别辨认及遗传病连锁剖析等方面运用广泛[3-5]。可是法医学检案进程中，STR基因座的骤变现象不少见，会必定程度上影响案子定论，因而，法医学实践中学者们对骤变现象日益重视。在美国人群中，父源基因骤变率在0.007%～0.371%之间（来自美国血库协会研讨报导）[6]；而STR基因骤变率国内学者研讨报导在0.004%～0.404%
之间[7-10]。本研讨挑选了2016年度重庆区域人群的1596例支撑存在亲权联系的案子为查询研讨目标，剖析案子中22个常染色体STR基因座骤变状况及特色，以期储藏重庆区域STR 基因骤变的根底遗传学信息。现报导如下。
1 材料与办法
1.1 一般材料
1596例亲子判定事例均来自重庆市正鼎司法判定所的日常检测事例，三联体（父亲—孩子—母亲）亲子判定案子563例，二联体（父亲—孩子或母亲—孩子）1033例，判定定论均为支撑存在亲权联系。家系事例样本大部分为血液或血斑，小部分为唾液斑、带毛囊毛发。
1.2 仪器和试剂
VeritiTM96-Well Thermal Cycler PCR 扩增仪（ 美国AB公司）；3130型或3500型DNA遗传剖析仪（美国AB公司）；AGCU Expressmarker22 荧光检测试剂盒（简称AGCU Ex22 kit）和AGCU 21+1 STR荧光检测试剂盒（简称 AGCU 21+1 kit）（我国无锡中德美联公司）。
1.3 办法
1.3.1 DNA提取
样本的基因组DNA选用Chelex-100法提取。
1.3.2 PCR扩增
选用AGCU Ex22 kit对22个STR基因座（D3S1358、D13S317、D7S820、D2S441、TPOX、TH01、D2S1338、D16S539、Penta E、CSF1PO、Penta D、D10S1248、D19S433、vWA、D21S11、D18S51、D6S1043、D8S1179、D5S818、D12S391和FGA）及1个性别基因座Amelogenin进行聚合酶链反应（PCR）复合扩增。PCR扩增系统为10 μL，每管含Reaction Mix 4.0 μL、EX22 Primers 2.0 μL、热启动C-Taq酶0.4 μL、DNA模板1.0 μL（DNA浓度为0.5～2 ng/μL）和sdH2O 2.6 μL。PCR循環条件为初始变性95℃ 2 min，热循环（10个循环：94℃ 2 min，60℃ 1 min，72℃1 min；20个循环：90℃2 min，58℃1 min，72℃
1 min），终延伸72℃ 10 min，保温4℃保持。每个扩增系统中建立阳性对照DNA为女人细胞株9947A和阴性对照（空白DNA用去离子水代替）。若呈现1-2个不契合遗传规则的STR基因座，加测AGCU 21+1 kit。AGCU 21+1 Kit含22个STR基因座（D10S1248、D6S474、D12ATA63、D2S441、D22S1045、D1S1677、D11S4463、D1S1627、D3S4529、D19S433、D6S1017、D4S2408、D17S1301、D2S1776、D1GATA113、D18S853、D20S482、D14S1434、D9S1122、D10S1435和D5S2500）及1个性别基因座Amelogenin，其间D10S1248、D2S441和D19S433这3个STR基因座为AGCU EX22 kit和AGCU 21+1 kit共有，能够进行复核比对。
AGCU 21+1 kit的PCR扩增系统为10 μL，每管含Reaction Mix 4.0 μL、Primers 21+1 2.0 μL、热启动C-Taq酶0.3 μL、DNA模板1.0 μL（DNA浓度为0.5～2 ng/μL）和sdH2O2.7 μL。每个扩增系统中建立阳性对照DNA为女人细胞株9947A和阴性对照（空白DNA用去离子水代替）。PCR循环条件为初始变性95℃ 2 min，热循环（30个循环：94℃ 30sec，60℃ 1 min，65℃ 1.5 min），终延伸60℃
1 hour，保温4℃保持。
1.3.2 STR基因座检测
运用3130或3500遗传剖析仪对扩增产品进行毛细管电泳，用Gene Mapper ID v3.2或Gene Mapper? ID-X软件对STR基因座进行剖析。分型规范含分子量内标和等位基因分型规范物。
1.3.3 STR骤变基因的断定
假如一切检测的22个STR基因座均契合孟德尔遗传规则，而且累计亲权指数（CPI）大于10000，则支撑存在亲权联系。假如有1或2个STR基因座成果违背遗传规则或CPI在0.0001至10000之间，本研讨添加AGCU 21+1 kit检测。参照司法部《亲权判定技术规范》（SF/ZJD0105001-2016）核算骤变基因座的PI。假如添加检测试剂盒没有发现新的违背遗传规则基因座而且核算CPI大于10000，那么支撑存在亲权联系。该违背遗传规则的基因座以为是骤变基因座。假如CPI小于0.0001，以为扫除存在亲权联系[11]。
1.3.4 STR基因座骤变剖析办法
骤变步数即为重复单位的添加（+n）或许削减（-n）。在爸爸妈妈的等位基因中，骤变基因以重复单位相差最小的亲代等位基因为准。假如步数相差相同，骤变基因参阅结构类似的等位基因。假如步数相同、结构类似即添加或许削减步数相同则判别为不能断定[9]。对骤变基因座的数量、骤变来历、骤变步数及重复单位的添加或削减进行核算，经过直接计数法和EXCEL软件核算骤变基因座的骤变率。别的，剖析骤变来历、骤变步数在全体骤变事情中所占份额。骤变相关要素之间的联系使用SPSS 15.0软件进行剖析，查验水准α=0.05。
2 结 果
2.1 STR基因骤变座剖析
1596例支撑存在亲权联系的亲子判定事例中，二联体案子有1033例，三联体案子有563例，共查询到2159次减数割裂。研讨中查询到52例骤变（二联体案子有22例，三联体案子有30例），其间51例是父亲或母亲一方有1个基因座发作骤变（98.11%），1例为父亲和母亲各有1个基因座发作骤变（1.89%）。22个被检测的STR基因座中有20个座查询到骤变，FGA基因座的骤变率最高，为9次（0.42%），其次D12S391基因座为6次（0.28%），Penta E基因座为5次（0.23%），D8S1179和vWA基因座为4次（0.19%），D13S317、TH01和D2S1338基因座为3次（0.14%），D16S539、CSF1PO、Penta D、D10S1248和D6S1043基因座为2次（0.09%），D3S1358、D7S820、D21S11、D18S51、D5S818为1次（0.05%）。此外，D2S441和TPOX基因座未查询到骤变（表1）。
2.2 骤变步数
STR基因座骤变步数在52例骤变事例中，共查询到53次骤变，其间一步骤变49次（92.45%），二步骤变1次（1.89%），三步骤变3次（5.66%）。一步骤变现象里削减1个重复单位（-1）有12次，添加1个重复单位（+1）有22次，不断定是添加或许削减1个重复单位的13次；两步骤变现象为削减2个（-2）重复单位；三步骤变分别为2个（+3）和1个（-3）重复单位。骤变等位基因的步数比较，差异有核算学含义（x2=126.423，
P<0.001）。
2.3 骤变来历
在查询到的53次骤变中，50次来历于父系，占94.34%，3次来历于母系，占5.66%，不能断定无。父系来历骤变与母系来历骤变的份额约16.67：1，差异有核算学含义（x2=83.358，P<0.001）。
3 讨 论
3.1 STR基因座的骤变率剖析
研讨STR基因座的骤变率应该至少要查询500次细胞减数割裂[12]。本文选用AGCU EX22 kit检测并核算了1596例支撑存在亲权联系的事例。研讨成果发现共有2159次减数割裂，其间有20个基因座存在基因骤变现象，骤变率在0.05%～0.42%之间，略高于美国血库协会2008年发布的年度数据。针对基因座的结构和重复序列中中心序列的重复次数剖析，发现骤变率可能与基因座的多态性及片段长度有关。如中心序列重复次数大于10次的FGA、
Penta E、vWA、D8S1179基因座骤变率较高。一般运用于亲权判定的遗传符号STR的总骤变率应不高于0.2%。本研讨中FGA、Penta E、D12S391基因座的總骤变率大于0.2%，因而在法医证据检案中应留意骤变问题，必要时采纳其他手法辅佐判定以下降误判危险。此外，本次研讨显现三联体的骤变率是5.33%（30/563），二联体的骤变率是2.13%（22/1033），三联体的骤变率显着高于二联体，发作此状况的原因可能是二联体少了父亲或母亲一方的遗传信息，部分骤变事例没能被发现。
3.2 STR基因座的骤变机制及形式剖析
STR基因座骤变机制以为首要因为仿制滑动或仿制滑链错配引起。常用的STR基因座骤变率在0.1%～0.5%。STR基因座的骤变体现为重复单位数意图改动，首要分为两类：一步骤变和多步骤变[13-14]。串联摆放的正向重复序列以及重复次数较多的序列中发作仿制滑链错配的概率较大，骤变率也相应较大。步数越少，发作骤变的概率相对较大。别的一步骤变可经过累积发作多步骤变。STR基因座首要是以逐渐骤变形式发作，以单个重复单位的增减为主，占90%以上，两个或许更多重复单位改动较少见。本研讨成果显现一步骤变率为92.45%，显着高于二步和三步骤变，与先前所报导的成果共同[15]。
3.3 STR基因座骤变与性别、年纪
据李秋阳等报导，性别差异在骤变现象中较显着，男性于女人发作骤变的份额为8：1，此外骤变与父亲年纪相关，骤变率随父亲的年纪的添加也有添加趋势[16]。本研讨显现父系与母系来历的骤变存在明显的性别差异（份额为16.67：1），这和李秋阳等报导的成果共同。发作明显差异的原因可能是在男性精母细胞逐渐割裂成精子的进程中，细胞需求的割裂次数比女人配子细胞老练需求割裂的次数要多得多，所以发作骤变的概率变大。本文查询到50例STR基因座骤变来历于父亲，他们生育小孩的年纪最小25岁，最大54岁。
3.4 STR基因座骤变的应对
在亲权判定案子中，依照司法部《亲权判定技术规范》（SF/ZJD0105001-2016）要求，判定中遗传符号累计非父扫除率均应不小于0.9999，核算CPI>10000视为支撑存在亲权联系；CPI<0.0001，则扫除存在亲权联系。假如0.0001
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本文修改：王雨辰
