周泉 李清华
摘要：意图：探究Hsp22维护SCA3/MJD转基因果蝇神经的机制。办法：使用GAL4-UAS体系，使Hsp22在SCA3/MJD转基因果蝇模型的神经体系中表达。调查果蝇的羽化率，Western blot查看线粒体复合物I亚基NDUFS3的蛋白水平。成果：Hsp22诱导不能羽化的elav-GAL4/UAS体系启动的SCA3/MJD转基因果蝇部分羽化，线粒体复合物I亚基NDUFS3蛋白表达升高。定论：Hsp22或许经过改进线粒体功用对SCA3/MJD转基因果蝇神经起维护效果。
关键词：SCA3/MJD；线粒体功用；Hsp22；转基因果蝇模型；神经维护
中图分类号：R741
文献标志码：A
文章编号：1008-2409（2015）01-0021-03
脊髓小脑性共济失调是以小脑共济失调为主，表现为走路摇晃、俄然跌倒和说话含糊不清，以及双手蠢笨、意向性震颤及眼球震颤、远端肌萎缩和发呆等的神经退行性疾病。现在，发现SCAs基因亚型现已超越30种。其间，脊髓小脑性共济失调3型/马查多-约瑟夫病是最常见的SCAs亚型。在我国，SCA3/MJD简直占SCAs患者总数的一半。
热休克蛋白（heatshock proteins，HSPs）广泛存在于从细菌至哺乳动物间的多种生物。机体遇到高温等影响时，很多组成HSPs，以帮忙保持劳累细胞的生理活动，减轻对机体的危害。小热休克蛋白22是HSPs的重要成员，定坐落线粒体，具有分子伴侣活性、抗氧化应激及延伸寿数等广泛生物学效果。笔者前期研讨发现，Hsp22对SCA3/MJD转基因果蝇具有维护效果，而Hsp22对SCA3/MJD维护效果的机制尚不清晰。为评论Hsp22对SCA3/MJD维护效果的机制，笔者构建了elav-GAIA/UAS体系SCA3/MJD转基因果蝇模型，调查Hsp22表达对elav-GAL4/UAS体系SCA3/MJD转基因果蝇模型的影响。
1资料与办法
1.1资料
野生型基因W1118、双平衡基因Sco/cyo；TM3/TM6的果蝇由中南大学医学遗传学国家重点实验室捐献；基因型w[*]；P{w[+mC]=UAS-Hsp/MJDtr-Q78}c211.2的8150果蝇品系（简称UAS-MJDtr-Q78果蝇），基因型P{w[+mW.hs]=GawB}elav[C155]的458果蝇品系（简称elav-GAL4果蝇）均购自美国Bloomington果蝇中心；Hsp22果蝇由Jose·Botella-Munoz赠予。
1.2办法
1.2.1elav-GAL4/UAS体系转基因果蝇羽化率测定 （1）elav-GAL4/UAS体系正常果蝇羽化率测定。将elav-GAIA童贞蝇与W1118雄果蝇杂交，在25℃恒温培育箱中培育。在杂交第4天，铲除亲代果蝇，并用毛笔轻扫起100只二龄幼虫（基因型为：elav-GAL4/W1118）于新的培育管中持续培育。杂交第10天开端核算羽化为成虫的果蝇数，并核算羽化率。（2）elav-GAL4/UAS体系SCA3/MJD转基因果蝇羽化率测定。将elav-GAL4童贞蝇与UAS-MJDtr-Q78雄果蝇杂交，在与上组果蝇相同的时刻，以相同的办法核算羽化率。（3）Hsp22干涉elav-GAL4/UAS体系SCA3/MJD转基因果蝇的羽化率测定。将w；Sco/Cyo；TM3/TM6童贞蝇与UAS-MJDtr-Q78雄果蝇杂交，构建w；AS-MJDtr-Q78/Sco；TM3/+果蝇；将w；Sco/Cyo；TM3/TM6童贞蝇与UAS-Hsp22雄果蝇杂交，构建CyO/+；UAS-Hsp22/TM6果蝇。将上述两个子代男女果蝇杂交，选出w；UAS-MJDtr-Q78/CyO；UAS-Hsp22/TM3果蝇。将elav-GAL4童贞蝇与UAS-MJDtr-Q78/CyO；UAS-Hsp22/TM3雄果蝇杂交，在子代中除掉Cyo（卷翅）及TM3（短刚毛），并按上述办法剖析100只幼虫，核算羽化率。
1.2.2Western blot测定果蝇NDUFS3蛋白表达
（1）安排蛋白提取。选取正常果蝇、SCA3/MJD疾病果蝇及Hsp22干涉组果蝇二龄幼虫10只。参加300μl裂解液，别离总蛋白，并测定蛋白浓度。（2）制造适宜上样浓度、变性，然后上样电泳。先用50mA、35min恒流，跑到别离胶时，调至70～80mA，1h。（3）蛋白别离后进行转膜。先高电压：200V，40W；再高电流：300mA，200W（45min时替换冰袋）进行半干转。（4）膜上蛋白抗原与抗-NDUFS3和二抗杂交。（5）底物进行ECL化学发光、显影与定影。
2成果
2.1果蝇羽化率
正常对照组果蝇幼虫均羽化成成虫，SCA3/MJD疾病果蝇在3龄幼虫期或化蛹期彻底致死，其羽化率为0，而Hsp22干涉组果蝇幼虫羽化率为28%，3组比较差异有核算学含义。Hsp22干涉组果蝇幼虫羽化率高于SCA3/MJD疾病果蝇。
2.2果蝇NDUFS3蛋白表达
SCA3/MJD疾病果蝇的NDUFS3蛋白条带色彩浅，灰度低，其NDUFS3蛋白表达低于正常对照组果蝇和Hsp22干涉组果蝇。见图1。
3评论
许多神经退行性疾病，如SCA3/MJD，帕金森病等，与线粒体功用障碍有关。果蝇与人类基因有高同源性，且体积小，繁衍快，养殖简单，基因组少。因而，果蝇成为遗传学抱负的研讨“载体”。果蝇的繁衍周期分为：卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹，最终羽化为成虫。elav-GAL4体系SCA3/MJD转基因果蝇多发育至3龄幼虫时即中止发育并逝世。线粒体是细胞生成ATP的场所，氧化呼吸链存在于线粒体内膜。线粒体功用障碍导致氧化呼吸链受损，ATP产出削减。线粒体氧化呼吸链复合物I（简称复合物I）是呼吸链电子传递的开始复合物，是电子传递进程的限速酶，其损害会导致帕金森病的发作。复合物I由45个亚基组成，包含核基因编码行使电子传递效果的NDUFS3。前期研讨发现，线粒体功用受损与SCA3/MJD、帕金森病等神经退行性疾病联系密切。
Hsp22是HSPs的重要成员，作为分子伴侣发挥抗氧化应激等功用。一起，Hsp22是一种线粒体蛋白，线粒体对活性氧簇十分灵敏，进步Hsp22表达水平有助于维护线粒体蛋白防护氧化应激。Hsp22可以抢救elav-GAL4/+；MJDtr-Q78/+果蝇的羽化，而其效果机制尚不清楚。结合Hsp22、SCA3/MJD及线粒体之间的联系，笔者估测Hsp22或许经过康复线粒体的功用，维护SCA3/MJD转基因果蝇的神经体系。为证明这个假说，笔者选取elav-GAL4，使MJDtr-Q78蛋白在果蝇CNS特异性表达。发现Hsp22从头表达，果蝇的羽化功用康复，羽化率显着进步。Hsp22干涉后，SCA3/MJD转基因果蝇幼虫体NDUFS3蛋白表达显着升高。提醒Hsp22或许经过维护线粒体功用来维护SCA3/MJD。
Hsp22对SCA3/MJD转基因果蝇模型线粒体功用有维护效果，热休克蛋白对线粒体功用障碍引起的疾病有潜在的医治效果。
[责任编辑：向秋]endprint
