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来源:华夏医学 ·2019年08月19日 08:59 浏览量:1706

周泉 李清华

 

摘要:意图:探究Hsp22维护SCA3/MJD转基因果蝇神经的机制。办法:使用GAL4-UAS体系,使Hsp22在SCA3/MJD转基因果蝇模型的神经体系中表达。调查果蝇的羽化率,Western blot查看线粒体复合物I亚基NDUFS3的蛋白水平。成果:Hsp22诱导不能羽化的elav-GAL4/UAS体系启动的SCA3/MJD转基因果蝇部分羽化,线粒体复合物I亚基NDUFS3蛋白表达升高。定论:Hsp22或许经过改进线粒体功用对SCA3/MJD转基因果蝇神经起维护效果。

关键词:SCA3/MJD;线粒体功用;Hsp22;转基因果蝇模型;神经维护

中图分类号:R741

文献标志码:A

文章编号:1008-2409(2015)01-0021-03

脊髓小脑性共济失调是以小脑共济失调为主,表现为走路摇晃、俄然跌倒和说话含糊不清,以及双手蠢笨、意向性震颤及眼球震颤、远端肌萎缩和发呆等的神经退行性疾病。现在,发现SCAs基因亚型现已超越30种。其间,脊髓小脑性共济失调3型/马查多-约瑟夫病是最常见的SCAs亚型。在我国,SCA3/MJD简直占SCAs患者总数的一半。

热休克蛋白(heatshock proteins,HSPs)广泛存在于从细菌至哺乳动物间的多种生物。机体遇到高温等影响时,很多组成HSPs,以帮忙保持劳累细胞的生理活动,减轻对机体的危害。小热休克蛋白22是HSPs的重要成员,定坐落线粒体,具有分子伴侣活性、抗氧化应激及延伸寿数等广泛生物学效果。笔者前期研讨发现,Hsp22对SCA3/MJD转基因果蝇具有维护效果,而Hsp22对SCA3/MJD维护效果的机制尚不清晰。为评论Hsp22对SCA3/MJD维护效果的机制,笔者构建了elav-GAIA/UAS体系SCA3/MJD转基因果蝇模型,调查Hsp22表达对elav-GAL4/UAS体系SCA3/MJD转基因果蝇模型的影响。

1资料与办法

1.1资料

野生型基因W1118、双平衡基因Sco/cyo;TM3/TM6的果蝇由中南大学医学遗传学国家重点实验室捐献;基因型w[*];P{w[+mC]=UAS-Hsp/MJDtr-Q78}c211.2的8150果蝇品系(简称UAS-MJDtr-Q78果蝇),基因型P{w[+mW.hs]=GawB}elav[C155]的458果蝇品系(简称elav-GAL4果蝇)均购自美国Bloomington果蝇中心;Hsp22果蝇由Jose·Botella-Munoz赠予。

1.2办法

1.2.1elav-GAL4/UAS体系转基因果蝇羽化率测定 (1)elav-GAL4/UAS体系正常果蝇羽化率测定。将elav-GAIA童贞蝇与W1118雄果蝇杂交,在25℃恒温培育箱中培育。在杂交第4天,铲除亲代果蝇,并用毛笔轻扫起100只二龄幼虫(基因型为:elav-GAL4/W1118)于新的培育管中持续培育。杂交第10天开端核算羽化为成虫的果蝇数,并核算羽化率。(2)elav-GAL4/UAS体系SCA3/MJD转基因果蝇羽化率测定。将elav-GAL4童贞蝇与UAS-MJDtr-Q78雄果蝇杂交,在与上组果蝇相同的时刻,以相同的办法核算羽化率。(3)Hsp22干涉elav-GAL4/UAS体系SCA3/MJD转基因果蝇的羽化率测定。将w;Sco/Cyo;TM3/TM6童贞蝇与UAS-MJDtr-Q78雄果蝇杂交,构建w;AS-MJDtr-Q78/Sco;TM3/+果蝇;将w;Sco/Cyo;TM3/TM6童贞蝇与UAS-Hsp22雄果蝇杂交,构建CyO/+;UAS-Hsp22/TM6果蝇。将上述两个子代男女果蝇杂交,选出w;UAS-MJDtr-Q78/CyO;UAS-Hsp22/TM3果蝇。将elav-GAL4童贞蝇与UAS-MJDtr-Q78/CyO;UAS-Hsp22/TM3雄果蝇杂交,在子代中除掉Cyo(卷翅)及TM3(短刚毛),并按上述办法剖析100只幼虫,核算羽化率。

1.2.2Western blot测定果蝇NDUFS3蛋白表达

(1)安排蛋白提取。选取正常果蝇、SCA3/MJD疾病果蝇及Hsp22干涉组果蝇二龄幼虫10只。参加300μl裂解液,别离总蛋白,并测定蛋白浓度。(2)制造适宜上样浓度、变性,然后上样电泳。先用50mA、35min恒流,跑到别离胶时,调至70~80mA,1h。(3)蛋白别离后进行转膜。先高电压:200V,40W;再高电流:300mA,200W(45min时替换冰袋)进行半干转。(4)膜上蛋白抗原与抗-NDUFS3和二抗杂交。(5)底物进行ECL化学发光、显影与定影。

2成果

2.1果蝇羽化率

正常对照组果蝇幼虫均羽化成成虫,SCA3/MJD疾病果蝇在3龄幼虫期或化蛹期彻底致死,其羽化率为0,而Hsp22干涉组果蝇幼虫羽化率为28%,3组比较差异有核算学含义。Hsp22干涉组果蝇幼虫羽化率高于SCA3/MJD疾病果蝇。

2.2果蝇NDUFS3蛋白表达

SCA3/MJD疾病果蝇的NDUFS3蛋白条带色彩浅,灰度低,其NDUFS3蛋白表达低于正常对照组果蝇和Hsp22干涉组果蝇。见图1。

3评论

许多神经退行性疾病,如SCA3/MJD,帕金森病等,与线粒体功用障碍有关。果蝇与人类基因有高同源性,且体积小,繁衍快,养殖简单,基因组少。因而,果蝇成为遗传学抱负的研讨“载体”。果蝇的繁衍周期分为:卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹,最终羽化为成虫。elav-GAL4体系SCA3/MJD转基因果蝇多发育至3龄幼虫时即中止发育并逝世。线粒体是细胞生成ATP的场所,氧化呼吸链存在于线粒体内膜。线粒体功用障碍导致氧化呼吸链受损,ATP产出削减。线粒体氧化呼吸链复合物I(简称复合物I)是呼吸链电子传递的开始复合物,是电子传递进程的限速酶,其损害会导致帕金森病的发作。复合物I由45个亚基组成,包含核基因编码行使电子传递效果的NDUFS3。前期研讨发现,线粒体功用受损与SCA3/MJD、帕金森病等神经退行性疾病联系密切。

Hsp22是HSPs的重要成员,作为分子伴侣发挥抗氧化应激等功用。一起,Hsp22是一种线粒体蛋白,线粒体对活性氧簇十分灵敏,进步Hsp22表达水平有助于维护线粒体蛋白防护氧化应激。Hsp22可以抢救elav-GAL4/+;MJDtr-Q78/+果蝇的羽化,而其效果机制尚不清楚。结合Hsp22、SCA3/MJD及线粒体之间的联系,笔者估测Hsp22或许经过康复线粒体的功用,维护SCA3/MJD转基因果蝇的神经体系。为证明这个假说,笔者选取elav-GAL4,使MJDtr-Q78蛋白在果蝇CNS特异性表达。发现Hsp22从头表达,果蝇的羽化功用康复,羽化率显着进步。Hsp22干涉后,SCA3/MJD转基因果蝇幼虫体NDUFS3蛋白表达显着升高。提醒Hsp22或许经过维护线粒体功用来维护SCA3/MJD。

Hsp22对SCA3/MJD转基因果蝇模型线粒体功用有维护效果,热休克蛋白对线粒体功用障碍引起的疾病有潜在的医治效果。

[责任编辑:向秋]endprint

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