蒋朝龙 史顶峰 李虎 高凤山
[摘要]意图：研讨甲基莲心碱对增生性瘢痕成纤维细胞中Bcl-2、Bax及Caspase-3 中mRNA和蛋白表达的影响。办法：体外培育增生性瘢痕成纤维细胞及正常皮肤安排，随机分为4组：对照组、甲基莲心碱低、中、高剂量组（5、10、20μg/ml）。各组别离参加不同浓度药物培育24h后，选用RT-PCR检测Bcl-2、Bax及Caspase-3 mRNA的表达，并运用Western Blot检测Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白的表达。成果：与对照组比较，低剂量组Bcl-2、Bax及Caspase-3 mRNA表达量均无显着变化（P>0.05）；中、高剂量组Bcl-2 mRNA表达量显着下降，Bax及Caspase-3 mRNA表达量显着增加，差异有统计学含义（P<0.05）。与对照组比较，低剂量组Bcl-2蛋白表达量无显着变化，中、高剂量组Bcl-2蛋白表达量显着下降，差异有统计学含义（P<0.05）；低、中、高剂量组Bax及Caspase-3蛋白表达量均显着增加，差异有统计学含义（P<0.05）。定论：甲基莲心碱能上调增生性瘢痕成纤维细胞中Bax、Caspase-3的表达，一起下调Bcl-2的表达。
[要害词]甲基莲心碱；增生性瘢痕成纤维细胞；Bcl-2；Bax；Caspase-3
[中图分类号]R285.5 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2018）03-0107-03
Research of Influence of Neferine on expression of Bcl-2， Bax and Caspase-3 in Hypertrophic Scar Fibroblast
JIANG Zhao-long，SHI Gao-feng，LI Hu，GAO Feng-shan
（Department of Plastic Surgery，Affiliated Hoapital，Jiangnan University，Wuxi 214062，Jiangsu，China）
Abstract： Objective To research the influence of neferine on the expression of mRNA and protein in Bcl-2， Bax and Caspase-3 in hypertrophic scar fibroblast. Methods Hypertrophic scar fibroblasts and normal skin tissue were cultured in vivo and randomly divided into four groups， namely， the control group， low， medium and high dose groups of neferine（5，10，20μg/ml）. After drugs with different concentrations are respectively added into each group for culture for 24 hours， the expression of Bcl-2， Bax and Caspase-3 mRNA was detected by RT-PCR， and the expression of Bcl-2， Bax and Caspase-3 protein was detected by Western Blot. Results Compared with the control group， there was no significant change in the expression of Bcl-2， Bax and Caspase-3 mRNA in the low dose group（P>0.05）. The expression of Bcl-2 in medium and high dose group decreased obviously， and the expression of Bax and Caspase-3 significantly increased（P<0.05）. Compared with the control group， there was no significant change in the expression of Bcl-2 protein in the low dose group， and the expression of Bcl-2 in the middle and high dose groups decreased significantly（P<0.05）. And the expression of Bax and Caspase-3 in the low， middle and high dose groups increased obviously（P<0.05）. Conclusion Neferine can upregulate the expression of Bax and Caspase-3 in hypertrophic scar fibroblast and downregulate the expression of Bcl-2 therein as well.
Key words： neferine； hypertrophic scar fibroblasts； Bcl-2； Bax； Caspase-3
增生性瘢痕（Hypertrophic Scar）往往由手術、外伤及烧伤构成，发病机制与延伸的炎症反响及伤口愈合增殖有关[1]。成纤维细胞增殖及凋亡反常与增生性瘢痕的构成密切相关[2]。临床医治办法有手术切除、激光、放疗等，但毒副效果大及复发率高，故值得进一步研讨其发病机制和防治药物[3]。甲基莲心碱（neferine）是从睡莲科植物莲的老练种子绿色胚芽中提取的生物碱，属双苄基异喹啉化合物，分子式为C38H44N2O6[4]。有研讨发现其能按捺增生性瘢痕成纤维细胞的增殖[5]，但其详细效果机制仍未说明。有报导发现其能经过线粒体途径诱导HSC-T6凋亡，详细机制与Bax，Bcl-2和Caspase-3的表达改动有关[4]。本试验研讨甲基莲心碱对瘢痕成纤维细胞Bcl-2、Bax及Caspase-3表达的影响，以剖析其按捺瘢痕成纤维细胞的机制，为临床运用供给根据。
1 材料和办法
1.1 试剂与仪器：甲基莲心碱（CHENGDU MUST Bio-technology）；DMSO（美国Sigma公司）；marker和琼脂糖（Promega公司）；2×Taq MasterMix（康为世纪）；引物组成（北京奥科鼎盛生物技术公司）；RNA 提取试剂盒fastgen200（上海飞捷生物技术有限公司）；逆轉录试剂盒（TaKaRa）；兔抗人Bcl-2、Bax、Caspase-3、β-actin 多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司。CO2恒温箱（Thermo公司）；超净工作台（天津市泰斯特仪器有限公司）；RT-PCR仪（AB Applied Biosystems）；电泳仪（美国BIO-RAD公司）；凝胶成像剖析体系（培清科技）。
1.2 标本来历：增生性瘢痕安排取自江南大学隶属医院整形外科的增生性瘢痕患者。均契合增生性瘢痕的临床确诊规范，术后病理确诊与临床确诊共同，且患者无长时间外用抗瘢痕药物史，不兼并肿瘤及其他严峻疾病。一起取4例其他外科手术患者创缘的正常皮肤安排，均无结缔安排疾病，无心、肺、肝、肾等缓慢疾病，近期未运用过糖皮质激素、抗肿瘤药物等，且未接受过放疗。
1.3 增生性瘢痕成纤维细胞的培育：选用安排块培育法进行增生性瘢痕成纤维细胞的原代培育。取新鲜增生性瘢痕安排，用0.5%新洁尔灭漂洗2次，每次3min，再用0.9%生理盐水重复冲刷。在无菌工作台内，去除表皮及皮下安排。在少数胎牛血清中将瘢痕安排剪成0.5～1mm巨细的安排块，接种于塑料培育皿中，安排块距离约0.5mm，在5%CO2，37℃饱和湿度和95%空气条件下培育4h，使安排块粘附，然后参加1640培育基（含20%小牛血清，青、链霉素各100U/ml）适量，持续培育，每3～5d换液1次。3～4周后，待原代细胞成长根本融组成片时，用0.25% 胰蛋白酶消化，按1：2或1：3的份额分种传代培育，今后每3～5d传代一次。取3～6代细胞进行试验。以2×104个/孔细胞接种于24孔细胞培育板中，从次日起，每天用血球计数器计数3孔细胞，核算均值。
1.4 试验分组：运用DMSO溶解甲基莲心碱。试验分为4组，即对照组、甲基莲心碱低、中、高剂量组（5、10、20μg/ml）。取对数期成长细胞，培育于6孔板上，每孔参加2ml培育基，培育24h，待细胞成长至50%时，替换培育基为无血清DMEM，饥饿24h，再替换为10% FBS的DMEM，一起参加各组药物培育24h，进行RT-PCR及Western Blot试验。
1.5 RT-PCR测定各组细胞中mRNA表达水平：选用RNA提取试剂盒fastgen 200提取细胞总RNA。逆转录选用TaKaRa法，反响体系为10μl，内含500ng RNA，5×Primescript Buffer 2μl，终究RNase free H2O定容到10μl，按反响条件37℃ 15min，85℃ 5s 在RT-PCR仪上反响，冷却至-20℃ 保存。PCR反响体系为25μl，内含cDNA 2μl，上、下流引物各参加0.5μl（引物序列见表1），2×Taq Master Mix 12.5μl，RNase free H2O 9.5μl。PCR反响条件：94℃预变性5min，94℃变性30s， 56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃后延伸5min，冷却至4℃保存。PCR扩增产品用20ng/L琼脂糖凝胶电泳并照相，用Gel-pro Analyzer软件进行灰度剖析，以各因子条带与内参条带的光密度比值代表其mRNA相对表达水平。每个试验组重复5次。
1.6 Western Blot检测各组细胞中蛋白表达水平：搜集经0、5、10、20μg/ml甲基莲心碱处理24h后的细胞，PBS洗刷，参加裂解液，置于4℃下裂解15min提取总蛋白，测定蛋白浓度并定量，用质量分数为12%的SDS-PAGE电泳分离后，转移到PVDF膜上，以质量分数为5%脱脂奶粉室温关闭1h，参加1：500稀释的一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，参加1：5 000稀释的二抗，室温孵育1h，洗膜3次。运用ECL进行显影检测，以Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白与内参β-actin蛋白的IOD比值作为意图蛋白的相对表达量。
1.7 统计学剖析：统计学剖析运用SPSS 19.0软件。数据均以均数±规范差（x?±s）表明，选用单因素方差剖析（One-way ANOVA）比较多组间均数差异，组间比较运用最小显着差异法（LSD-t）。P<0.05表明差异具有统计学含义。
2 成果
2.1 各组细胞中Bcl-2，Bax及Caspase-3 mRNA表达量测定成果：与对照组比较，低剂量组Bcl-2、Bax及Caspase-3 mRNA表达量均无显着变化（P>0.05）；中、高剂量组Bcl-2 mRNA表达量显着下降，Bax及 Caspase-3 mRNA表达量显着增加，差异有统计学含义（P<0.05）。见表2，图1。
2.2 各组细胞中Bcl-2，Bax及Caspase-3 蛋白表达量测定成果：与对照组比较，低剂量组Bcl-2蛋白表达量无显着变化，中、高剂量组Bcl-2蛋白表达量显着下降，差异有统计学含义（P<0.05）；与对照组比较，低、中、高剂量组Bax及Caspase-3蛋白表达量均显着增加，差异有统计学含义（P<0.05）。见表3，图2。
3 评论
增生性瘢痕与伤口愈合过程中成纤维细胞过强的功用及细胞外基质的过度累积有关，安排学上其首要由平行于皮肤外表的Ⅲ型胶原构成[6]。增生性瘢痕成纤维细胞的增殖活性较正常皮肤来历成纤维细胞增强[7]，一起增生性瘢痕存在很多凋亡反常，如其间抗凋亡蛋白Bcl-2的表达比正常皮肤安排高，增生性瘢痕来历的成纤维细胞反抗Fas介导的凋亡等[8]。这或许导致增生性瘢痕成纤维细胞对凋亡发生反抗，进而失控性的生成很多胶原纤维[8]。甲基莲心碱因具有抗肝脏纤维化的功用广受重视，其机制或许与其按捺肝星状细胞增殖，一起促进肝星状凋亡有关[4，9]。因为增生性瘢痕的病理生理机制与肝纤维化存在相似性，因而两者的研讨往往能够彼此学习。有研讨发现甲基莲心碱能剂量依靠性地按捺体外培育瘢痕成纤维细胞的增殖，并能削减移植至裸鼠的人增生性瘢痕的体积，一起改动Ⅰ、Ⅲ型胶原成分，下降胶原和酸性粘多糖含量的效果，但现在尚无对其潜在机制的研讨[5]。本研讨即开始探讨了甲基莲心碱按捺瘢痕成纤维细胞增殖的机制。
本试验发现甲基莲心碱能上调增生性瘢痕成纤维细胞中Bax、Caspase-3的表达，一起下调Bcl-2的表达。而Bcl-2、Bax及Caspase-3都是细胞凋亡中的要害分子[4]。凋亡首要经过两条根本通路：逝世受体通路和线粒体通路，其间线粒体通路首要与Bcl-2宗族蛋白有关[10]。线粒体中促凋亡因子的开释首要受Bcl和Bax的调控，Bcl和Bax都是线粒体膜相关的Bcl-2宗族蛋白，Bcl与Bax之间的彼此效果决议了细胞的存亡[10]。Bcl-2是一种具有抗凋亡活性的膜整合蛋白，它能使细胞反抗凋亡。Bax则是Bcl-2宗族中的促凋亡蛋白，Bax从细胞浆转移至线粒体膜外层后，进而与Bcl-2蛋白组成异源二聚体，该二聚体能在线粒体上发生孔道，介导细胞色素C的开释[8]。试验中发现跟着甲基莲心碱浓度的增高，Bcl-2的表达有下降趋势，其间中、高剂量组较低剂量组、对照组显着性下降；一起Bax的表达有升高趋势，3个剂量组均较对照组显着性升高。而Bcl-2的下降和Bax的增高或许经过线粒体通路促进细胞凋亡。Caspase-3作为凋亡中最重要的一个效应分子，是多种凋亡信号通路的终究汇集点，也是凋亡的首要执行者[11]。试验中跟着甲基莲心碱浓度升高，细胞中Caspase-3的表达有升高趋势，且中、高剂量组与对照组、低剂量组之间的差异有统计学含义。故Caspase-3的高表达或许参加了瘢痕成纤维细胞的凋亡，这或许是甲基莲心碱按捺该细胞的潜在机制。
综上所述，甲基莲心碱能下调增生性瘢痕成纤维细胞中Bcl-2的表达，上调Bax的表达，一起显着上调Caspase-3的表达，这或许是甲基莲心碱诱导意图细胞凋亡的潜在机制。本试验仅研讨了甲基莲心碱对体外培育细胞的效果，但其对体内增生性瘢痕安排中成纤维细胞的影响有待进一步研讨。现在增生性瘢痕尚无抱负的医治药物，甲基莲心碱因其纯天然、毒副效果较小等优势，且契合国家近期拔擢中医药开展的精力，进一步研讨其按捺瘢痕成纤维细胞的机制，使其有望成为医治增生性瘢痕的一个新挑选。
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[收稿日期]2017-12-20 [修回日期]2018-02-01
修改/朱婉蓉
