卢婉怡
[摘要] 意图 优化纤维素酶进步青蒿素提取率的反响条件。 办法 运用呼应面试验办法选用中心组合试验规划研讨酶反响进程中时刻、加酶量、温度对提取率的影响，并对提取工艺条件进行优化。 效果 纤维素酶辅佐提取青蒿素的最优工艺条件：酶反响时刻2.9 h，酶增加量0.20 g，反响温度42.6℃。 定论 呼应面试验办法可以有用进步纤维素酶辅佐提取青蒿素的提取率。
[关键词] 青蒿素；纤维素酶；提取；呼应面
[中图分类号] R94 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）01（a）-0004-03
青蒿素（Artemisinin）是从菊科植物黄花蒿（Art-emisia annua L.）的枯燥地上部分提取别离得到[1]，因其含有过氧基团的倍半萜内酯结构，使其对疟疾具有“高效、速效、低毒”的杰出效果[2]，被世界卫生安排（WHO）称为“世界上仅有有用的疟疾医治药物”。虽然青蒿素的化学组成、生物组成及安排培养相继成功，但因为其产率低、本钱高而难以投入工业化出产。青蒿素药物的出产首要依托从天然青蒿中提取[3]。工业化青蒿素提取办法中运用最广的是惯例有机溶剂提取法[4]，常用溶剂包含乙醇、溶剂汽油和石油醚等[5]。因为青蒿素在黄花蒿中含量低，惯例有机溶剂提取法存在提取率低、耗时长、溶剂耗费大等问题[6]。近年来，一些用于天然产品提取的新技能不断涌现，如微波、超声波和酶技能等，取得了明显成效。其间酶技能具有反响功率高、条件温文、提取时刻短、专一性强、易于控制和有用成分损坏少等长处[7]，是许多研讨的热门。可用于辅佐提取的酶的品种许多，纤维素酶是最常用的酶类之一，它可以水解纤维素-1，4-糖苷键，损坏细胞壁的细密结构，然后进步提取率，因而在中草药有用成分的别离提取方面取得了不少效果[8]。
我国是黄花蒿的主产国，资源丰富，植物提取青蒿素的产值占全球青蒿素产值的90%以上。将酶技能运用于青蒿素的提取进程，对进步青蒿素的提取功率、充分运用资源有重要意义。本研讨调查了纤维素酶辅佐提取青蒿素的条件，运用呼应面试验剖析酶反响进程各要素对提取率的影响，并优化酶辅佐提取工艺，为纤维素酶在青蒿素提取工艺上的运用供给参阅。
1 资料与办法
1.1仪器与试药
FW135型中药破坏机（天津泰斯特仪器有限公司），752型紫外-可见分光光度计（上海菁华科学仪器有限公司）。
青蒿药材购于广州市清平中药材商场，经本校张小红讲师鉴定为菊科植物黄花蒿的枯燥地上部分，药材经破坏后过40目筛备用。纤维素酶Cellulase T4[来源于绿色木霉（Trichoderma viride）]购自天野酶制剂（上海）有限公司，比生机40 000 U/g（按滤纸崩解力，天野法核算）。青蒿素规范品（百灵威科技有限公司，纯度>98%）。无水乙醇、95%乙醇、氢氧化钠、乙酸和乙酸钠等试剂均为剖析纯。
1.2 办法
1.2.1 纤维素酶辅佐提取青蒿素的办法 称取1 g破坏后的青蒿样品置于100 ml具塞三角瓶中，参加50 ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH=4.5），先常温下浸泡10 min，再参加必定量的纤维素酶，然后在必定温度下水浴振动进行酶反响。酶反响完毕后抽滤，将滤饼置于100 ml具塞三角瓶中，参加50 ml无水乙醇，在45℃下水浴振动1 h，抽滤，取滤液测定青蒿素含量。
1.2.2 青蒿素含量的测定办法 青蒿素仅在紫外区203 nm处有较弱的结尾吸收，但与碱反响后，生成一化合物Q292，该物质在292 nm处有最大吸收，可用紫外分光光度法检测[9]。取样品溶液0.5 ml参加95%乙醇4.5 ml，再参加0.2% NaOH 20 ml定容至25 ml，50℃水浴加热30 min，取出快速冷却，在292 nm处测定吸光值，每组测定三个平行样品，取平均值。依据规范曲线换算出青蒿素含量。
1.2.3 呼应面试验办法 呼应面试验是经过对呼应面等值线的剖析，选用多元二次回归方程来拟合要素与呼应值之间函数联系的一种计算办法。具有试验次数少、精度高级长处；一起还可以对各因子的交互效果进行点评，快速有用的断定最佳条件。其间包含多种规划办法，本研讨运用Designexpert 7.0软件进行规划试验与剖析，呼应面试验选用中心组合规划。中心组合规划试验中每种要素取5种水平，以（-α、-1、0、1、α）编码（本试验中α=1.414）。本试验选取酶反响时刻（A）、酶反响温度（B）和酶增加量（C）作为影响要素，中心组合试验的编码和水平见表1。
2 效果
2.1 青蒿素含量测定的规范曲线
准确称取青蒿素规范样品10 mg，溶于95%乙醇溶液，定容至100 ml容量瓶中，配制成0.1 g/L的规范溶液。别离取规范溶液0、1、2、3、4、5 ml，加95%乙醇溶液至5 ml，再参加0.2% NaOH 20 ml定容至25 ml，50℃水浴加热30 min，取出快速冷却，在292 nm处测定吸光值，每组取三个平行样品，取平均值。以青蒿素样品浓度x（g/L）为横坐标，292 nm吸光值y为纵坐标作图，效果得线性方程为D292=1.065c+0.019（r2=0.9971）。
2.2 呼应面试验效果
运用Designexpert 7.0软件规划的中心组合试验数n=12，试验规划表及效果如表2所示，试验次第为随机安排。
对中心组合试验的效果在Designexpert 7.0软件中进行方差剖析（ANOVA），效果标明，模型的P=0.0096，标明模型明显。对要素的交互效应剖析标明，A、C、BC和A2为明显影响要素，即酶反响时刻、加酶量、酶反响温度与加酶量交互效果和反响时刻的平方值为明显影响要素。模型相联系数r2=0.9979，标明模型在99.79%程度上可以解说酶辅佐提取率与变量之间的联系。模型的校对相联系数Adj r2=0.9882，与r2的数值相挨近标明模型猜测值和实践试验效果具有杰出的相关性。模型的变异系数（coefficient of variation，CV）为2.58%，标明模型的可信任程度高。
由试验效果剖析导出模型的二次方程：提取率R=2.34+0.19×A-0.042×B+0.70×C+0.15×A×B-0.035×B×C+0.17A2+0.031×B2-0.077×C2。运用Designexpert 7.0软件得出模型猜测最大值为3.24，此刻酶反响时刻为2.94 h，酶反响温度为42.62℃，酶增加量为0.199 g。对模型的猜测值进行验证，取酶反响时刻2.9 h，酶反响温度42.6℃，酶增加量0.2 g，进行三次平行试验，得到青蒿素提取率的平均值为3.27 mg/g，验证试验的提取率与猜测值根本符合，标明优化模型可以很好地阐明酶反响各要素与提取率之间的联系。与未选用酶辅佐提取时的提取率1.13 mg/g比较，优化后酶辅佐提取青蒿素的办法进步了1.89倍，标明酶辅佐提取能有用进步青蒿素的提取率。
3 评论
青蒿素首要存在与青蒿植物的茎叶安排中[2]，试验效果显现，纤维素酶Cellulase T4效果于青蒿可以进步其间青蒿素的提取率，标明恰当地运用纤维素酶处理可以战胜植物安排中纤维素的屏障效果，利于有用成分的溶出[10]。影响纤维素酶水解植物细胞壁反响的首要要素包含酶用量、酶反响温度和酶反响时刻等[10]，本研讨运用呼应面试验进行剖析，并对酶辅佐提取青蒿素工艺中各明显影响要素进行优化，优化条件下青蒿素的提取率较未运用酶辅佐提取工艺进步了1.89倍。本研讨将纤维素酶运用于青蒿素辅佐提取方面，明显进步了青蒿素的提取率，为酶技能在中药制药范畴的研讨和运用供给了参阅。
[参阅文献]
[1] 张凤杰，刘祝祥，陈功锡.青蒿药用成分提取办法及检测技能研讨进展[J].吉首大学学报（自然科学版），2010，31（4）：103-107.
[2] 夏铮铮.青蒿药材及青蒿素系列药物的含量测定办法研讨[D].重庆：重庆医科大学，2006.
[3] 李子颖，李士雨，齐向娟.青蒿素提取技能研讨进展[J].中药研讨与信息，2002，4（2）：17-21.
[4] 杨家庆，林燕芳，詹利之.青蒿中青蒿素提取工艺的优化及含量测定[J].广东药学院院报，2012，28（1）：40-43.
[5] 陈秋实，陈孟兰，范晶.青蒿素提取研讨进展[J].武汉生物工程学院院报，2007，3（2）：120-125.
[6] 钱国平.黄花蒿中提取与纯化青蒿素的研讨[D].杭州：浙江大学，2007.
[7] 张圣燕.纤维素酶在天然产品提取中的运用研讨[J].广东化工，2011，38（9）：59-60.
[8] 张巾英，张明春.运用纤维素酶提取中草药有用成分的研讨进展[J].上海中医药杂志，2007，41（1）：79-81.
[9] 李春莉，王莎莉，王亚平，等.紫外分光光度法测定青蒿素的含量[J].重庆医科大学学报，2007，32（4）：413-415.
[10] 杨吉霞，蔡俊鹏，祝玲.纤维素酶在中药成分提取中的运用[J].中药材，2005，28（1）：64-67.
（收稿日期：2013-09-10 本文修改：林利利）
由试验效果剖析导出模型的二次方程：提取率R=2.34+0.19×A-0.042×B+0.70×C+0.15×A×B-0.035×B×C+0.17A2+0.031×B2-0.077×C2。运用Designexpert 7.0软件得出模型猜测最大值为3.24，此刻酶反响时刻为2.94 h，酶反响温度为42.62℃，酶增加量为0.199 g。对模型的猜测值进行验证，取酶反响时刻2.9 h，酶反响温度42.6℃，酶增加量0.2 g，进行三次平行试验，得到青蒿素提取率的平均值为3.27 mg/g，验证试验的提取率与猜测值根本符合，标明优化模型可以很好地阐明酶反响各要素与提取率之间的联系。与未选用酶辅佐提取时的提取率1.13 mg/g比较，优化后酶辅佐提取青蒿素的办法进步了1.89倍，标明酶辅佐提取能有用进步青蒿素的提取率。
3 评论
青蒿素首要存在与青蒿植物的茎叶安排中[2]，试验效果显现，纤维素酶Cellulase T4效果于青蒿可以进步其间青蒿素的提取率，标明恰当地运用纤维素酶处理可以战胜植物安排中纤维素的屏障效果，利于有用成分的溶出[10]。影响纤维素酶水解植物细胞壁反响的首要要素包含酶用量、酶反响温度和酶反响时刻等[10]，本研讨运用呼应面试验进行剖析，并对酶辅佐提取青蒿素工艺中各明显影响要素进行优化，优化条件下青蒿素的提取率较未运用酶辅佐提取工艺进步了1.89倍。本研讨将纤维素酶运用于青蒿素辅佐提取方面，明显进步了青蒿素的提取率，为酶技能在中药制药范畴的研讨和运用供给了参阅。
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[10] 杨吉霞，蔡俊鹏，祝玲.纤维素酶在中药成分提取中的运用[J].中药材，2005，28（1）：64-67.
（收稿日期：2013-09-10 本文修改：林利利）
由试验效果剖析导出模型的二次方程：提取率R=2.34+0.19×A-0.042×B+0.70×C+0.15×A×B-0.035×B×C+0.17A2+0.031×B2-0.077×C2。运用Designexpert 7.0软件得出模型猜测最大值为3.24，此刻酶反响时刻为2.94 h，酶反响温度为42.62℃，酶增加量为0.199 g。对模型的猜测值进行验证，取酶反响时刻2.9 h，酶反响温度42.6℃，酶增加量0.2 g，进行三次平行试验，得到青蒿素提取率的平均值为3.27 mg/g，验证试验的提取率与猜测值根本符合，标明优化模型可以很好地阐明酶反响各要素与提取率之间的联系。与未选用酶辅佐提取时的提取率1.13 mg/g比较，优化后酶辅佐提取青蒿素的办法进步了1.89倍，标明酶辅佐提取能有用进步青蒿素的提取率。
3 评论
青蒿素首要存在与青蒿植物的茎叶安排中[2]，试验效果显现，纤维素酶Cellulase T4效果于青蒿可以进步其间青蒿素的提取率，标明恰当地运用纤维素酶处理可以战胜植物安排中纤维素的屏障效果，利于有用成分的溶出[10]。影响纤维素酶水解植物细胞壁反响的首要要素包含酶用量、酶反响温度和酶反响时刻等[10]，本研讨运用呼应面试验进行剖析，并对酶辅佐提取青蒿素工艺中各明显影响要素进行优化，优化条件下青蒿素的提取率较未运用酶辅佐提取工艺进步了1.89倍。本研讨将纤维素酶运用于青蒿素辅佐提取方面，明显进步了青蒿素的提取率，为酶技能在中药制药范畴的研讨和运用供给了参阅。
[参阅文献]
[1] 张凤杰，刘祝祥，陈功锡.青蒿药用成分提取办法及检测技能研讨进展[J].吉首大学学报（自然科学版），2010，31（4）：103-107.
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[9] 李春莉，王莎莉，王亚平，等.紫外分光光度法测定青蒿素的含量[J].重庆医科大学学报，2007，32（4）：413-415.
[10] 杨吉霞，蔡俊鹏，祝玲.纤维素酶在中药成分提取中的运用[J].中药材，2005，28（1）：64-67.
（收稿日期：2013-09-10 本文修改：林利利）
