朱琳+彭军+王琳
[摘要] 意图 了解上饶市2013～2014年别离到的甲1亚型流感病毒HA1基因变异特性和规则，剖析WHO甲1亚型疫苗引荐株对上饶市甲1亚型流感的防备效果。 办法 收集流感病例咽拭子标本进行病毒别离，对别离到的甲1流感病毒选用RT-PCR办法扩增病毒基因，进行核苷酸序列测定，运用DNAStar、Mage软件对测序成果进行剖析和处理，且与WHO 2013～2014年引荐的疫苗株进行比对。 成果 2013～2014年10株甲1亚型流感病毒HA1没有发现核苷酸丢失和刺进，上饶市流感病毒别离株与WHO疫苗引荐株之间差异很小，只要A/JiangxiXinzhou/SWL116/2014株有2个变异位点坐落抗原决定簇A区和抗原决定簇B区内。 定论 2013～2014年WHO疫苗引荐株出产的疫苗对我市这两年甲1亚型流感具有必定的防备效果，可推行运用。
[关键词] 甲1亚型流感病毒；别离株；疫苗株；HA区
[中图分类号] R373.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）09（c）-0004-03
Analysis of the characteristics of HA1 gene in influenza virus subtype A1 in Shangrao city from 2013 to 2014
ZHU Lin PENG Jun WANG Lin ZHANG Yan-yan
Shangrao Center for Disease Control and Prevention，Jiangxi Province，Shangrao 334000，China
[Abstract] Objective To understand the characteristics and regularity of HA1 gene mutation in influenza virus subtype A1 isolated from 2013 to 2014 in Shangrao City，and to analyze the preventive effect of WHO subtype A1 vaccine against Shangrao. Methods Influenza case throat swab specimens were selected as the research object，and virus isolation was carried out，and the RT-PCR method was used to isolate the virus gene.The method was used to determine the nucleotide sequence.The results were analyzed and processed using Mage and DNAStar software.The vaccine strains recommended by WHO 2013 to 2014 were compared. Results 10 influenza HA1 virus was not found to be lost and inserted，and the difference between vaccine and WHO vaccine was very small，and only 2 of A/JiangxiXinzhou/SWL116/2014 strains were located in A region and B region. Conclusion 2013-2014 WHO vaccine recommended for the production of vaccine against the city of those years subtype A1 of influenza has a certain preventive effect，and can be used to promote.
[Key words] Influenza virus subtype A1；Isolate；Vaccine strain；HA region
流感病毒为正黏病毒科单链负股分节段RNA病毒，分为甲、乙、丙三型，其间甲型流感病毒外表血凝素是该病毒首要的抗原，能使人体发作维护性抗体， 但抗原变异频频，能重复有用地打破人体的免疫屏障，引起流感盛行[1-2]。2009年在墨西哥爆发的甲型H1N1流感，开始被称为“人感染猪流感”，后将其更名为“甲型H1N1流感”，其就是因为基因改动导致的抗原漂移，使疫苗不能有用防控，然后引起流感疫情的爆发。本研讨剖析上饶市甲型H1N1流感病毒HA1的基因序列改动状况，并与WHO疫苗引荐株进行比较，剖析流感疫苗特异性的维护效果，为流感的防备和操控供给科学支撑。
1 材料与办法
1.1 样本来历
2013～2014年流感监测哨点医院和疑似流感疫情收集的流感样病例咽拭子样本[3]。
1.2 病毒别离与判定
用狗肾传代细胞（MDCK）进行流感病毒别离，根据细胞病变和微量血凝试验（HA）来判别是否存在流感病毒，将HA滴度≥1∶8的样本选用血凝按捺试验（HI）进行流感病毒型别判定[4]。一切流感毒株悉数经过国家流感中心复核承认。MDCK和规范血清均由国家流感中心供给。
1.3 病毒挑选
随机抽取10株从不同年份病例咽拭子样本中别离到的新式甲型H1N1流感病毒，进行基因扩增和测序。
1.4 病毒RNA提取和RT-PCR扩增
取病毒细胞培养液200 μl，用德国QIAGEN的RNeasy Mini Kit试剂进行病毒RNA的提取，再运用QIAGEN的One Step RT-PCR Kit试剂进行RT-PCR试验。试验条件为60℃ 1 min，42℃ 10 min，50℃ 30 min，95℃ 15 min[2]。PCR循环为94℃ 40 s，50℃ 40 s，72℃ 1 min 30 s，35次循环，72℃ 10 min。
1.5 引物和核苷酸序列测定
引物1：5′-AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAA-CC-3′；引物2：5′-CAATGAAACCGGCAATGGCTCC-3′[5]。引物由上海生物工程技能服务有限公司组成，PCR产品序列测定送上海生物工程技能服务有限公司。
1.6 基因序列剖析
氨基酸和核苷酸剖析选用DNAStar 5.0、Mage 4.0序列剖析软件，将WHO北半球新式甲型H1N1流感疫苗引荐株A/California/07/2009（H1N1）的HA1基因序列作为参比剖析。
2 成果
2.1 2013～2014年上饶市流感病毒的别离状况
2013～2014年共别离判定流感病例样本2273件，别离到甲1亚型流感病毒47株。其间2013年别离判定流感病例样本1204件，别离到甲1亚型流感病毒26株；2014年别离判定流感病例样本1069件，别离到甲1亚型流感病毒21株。
2.2 氨基酸和核苷酸序列的剖析成果
随机抽取10株甲1亚型流感病毒进行HA1区核苷酸序列检测，选2013年别离的毒株4株，2014年别离的毒株6株。对HA1基因PCR产品经核苷酸序列测定、序列拼接后，经DNAStar 5.0、Mega 4.0软件剖析，每株病毒HA1基因片段均为1701 bp。2013年和2014年的疫苗株均为A/California/07/2009（H1N1），我市2013年和2014年别离株与疫苗株的同源性比对分别为97.7%～98.2%和97.7%～98.0%，2013和2014年变异数分别为7～9个和8～11个，在HA1基因序列的种系进化树上（图1），可见挑选的这10株甲1亚型毒株与A/California/07/2009（H1N1）在同一分支上，除 A/JiangxiXinzhou/SWL116/2014株有2个变异位点坐落抗原决定簇A区内和抗原决定簇B区内（表1），其他一切毒株均未在抗原决定簇区域发作变异，提示甲型H1N1疫苗具有很好的维护效果。
图1 上饶市2013～2014年甲1毒株HA1基因序列的种系进化树图
3 评论
HA和NA是流感病毒重要的外表抗原，它与盛行性感冒的传染性和盛行性十分亲近。甲1亚型流感病毒HA1区域上最罕见A、B、C、D和E 5个抗原决定簇，其间A和B抗原决定簇对流感病毒抗原性的影响最大，抗原决定簇区域上氨基酸发作替换，会引起HA和NA发作抗原漂移，然后引起流感病毒抗原性的改动[6-7]。因为HA和NA发作抗原漂移，人体在流感病毒感染后所发作的特异性抗体，不能有用阻挠新变种流感病毒的侵略，然后引起流感爆发盛行[8]。所以WHO根据全球流感监测网络，对各地流感盛行毒株进行剖析，每年对流感疫苗的构成作出相应改动，引荐新一轮的流感疫苗株供全球运用[9]。
在本研讨基因的种系进化树中，2013～2014年毒株与疫苗引荐株在一个分支上，这标明这两年毒株与疫苗引荐株亲缘性较近[10]。变异剖析更能阐明这点，经过对上饶市2013～2014年新式甲型H1N1流感毒株与疫苗引荐株A/California/07/2009（H1N1）比较，发现有氨基酸位点发作变异，其间2013年毒株变异位点有变异数为7～9个；2014年毒株变异位点有变异数为8～11个[11]，阐明上饶市新式甲型流感毒株变异的氨基酸位点逐年在增多，仍需求亲近重视。
研讨标明，一个具有盛行病学含义的流感新变种需在HA1区蛋白分子上至罕见4个以上的氨基酸发作替换，而且这4个替换需散布在2个以上抗原决定簇区[12]。本研讨中2014年有一株毒株A/JiangxiXinzhou/SWL116/2014有2个变异位点，分别在决定簇A区141位和决定簇B区192位发作一个氨基酸替换，其他一切毒株均未在抗原决定簇区域发作变异[11-12]。这阐明上饶市新甲型H1N1的HA1区的变异没有到达需求替换疫苗的程度，现在的疫苗仍对人群有维护效果，可是抗原位点的变异逐年增多，上饶市依然存在新式甲型H1N1流感再次盛行的危险[13]。
本研讨对在2013～2014年上饶市别离到的甲1亚型流感病毒HA1区进行核苷酸序列检测，并结合流感抗原性进行材料剖析，以探究当地流感毒株的基因变异和型别变迁规则，及时捕获有含义的流感变异毒株，辅导往后的流感确诊、监测和防控作业，为新式甲型H1N1流感病毒的防备和操控供给科学支撑。
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（收稿日期：2015-06-30 本文修改：卫 轲）
