邓伟坤++++李艳卿++++李敏研++++施静雯
[摘要] 意图 调查中药复骨方对糖皮质激素致骨质疏松骨折模型大鼠骨代谢及骨密度的影响。 办法 将48只SD大鼠随机分为根底组、模型组及医治组各16只。根底组仅给予肌内打针生理盐水1 mg/kg，模型组和医治组予肌内打针地塞米松1 mg/kg，1次/d，3次/周，用药8周树立糖皮质激素性骨质疏松（GIOP）模型。第8周末对3组大鼠手术构成单侧股骨闭合性骨折，骨折处选用金属内固定，仿制GIOP骨折模型。术后第2天开端医治组中药复骨方药液灌胃，继续8周。检测大鼠血清钙（Ca）、磷（P）、碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（BGP）目标，选用双能X线吸收法（DXA）丈量大鼠股骨骨密度。 成果 骨折术前，模型组大鼠骨密度值为（0.219±0.013） g/cm2，根底组骨密度值为（0.283±0.015） g/cm2，模型组骨密度值显着低于根底组（t=12.8970，P<0.05）。试验16周末，医治组股骨全长骨骨密度为（0.265±0.014） g/cm2，高于模型组（t=9.8403，P<0.05）。试验12周末，医治组大鼠血清Ca为（2.35±0.19） mmol/L、P为（2.47±0.23） mmol/L、ALP为（196.74±25.38） U/L及BGP为（1.33±0.25） μg/L，与模型组比较均显着升高，差异有统计学含义（P<0.05）。 定论 中药复骨方可显着进步GIOP骨折大鼠股骨骨密度，升高GIOP骨折大鼠血清Ca、P、ALP及BGP活性，促进骨构成，有助于GIOP骨折的愈合。
[关键词] 复骨方；骨代谢；骨密度；糖皮质激素性骨质疏松；骨折；大鼠
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）10（b）-0008-04
骨质疏松是骨代谢妨碍的一种全身性骨骼疾病，骨骼是动态改动的安排，骨变换进程是破骨细胞吸收旧骨、成骨细胞构成类骨质并进行矿化新骨的进程，当骨吸收大于骨构成果导致了骨质疏松症的发作。糖皮质激素性骨质疏松（glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP）是一种因内源或外源糖皮质激素所构成的的，以骨强度下降、骨折风险性添加为特征的代谢性骨病[1]，其发病率位居继发性骨质疏松症首位[2]。骨变换进程可以经过生化标志反映出来，直接显现成骨细胞与破骨细胞的活性，与骨构成有关的代谢目标有碱性磷酸酶（ALP）和骨钙素（BGP）等。本试验拟以肌内打针地塞米松致大鼠GIOP，并树立GIOP大鼠股骨闭合骨折模型，调查中药复骨方对模型大鼠骨代谢及骨密度的影响。
1 材料与办法
1.1 试验材料
1.1.1 试验动物 选取3个月龄雌性SD大鼠48只，清洁级，体质量（280±20） g，由广东省医学试验动物中心供给，动物合格证号：SCXK（粤）2008-0002。试验进程中，一切动物在平等清洁环境下分笼养殖，养殖房温度为（24±1）℃，湿度为50%～70%，每天光照与漆黑时刻各12 h，喂饲全价养分鼠饲料（购自广东中医药大学试验动物中心，合格证号：NO.11002900006734），自在进水。
1.1.2 试验药物 试验中药复骨方由骨碎补、杜仲、续断、千年健、红花、归尾、川芎等组成，药材购自广州大参林药房，由广州市番禺区何贤留念医院药剂科药房加工，药物煎煮后浓缩到含生药0.5 g/ml，4℃保存。地塞米松磷酸钠打针液（天津药业集团新郑股份有限公司出产，国药准字号H41021255，批号0807031，标准：1 ml∶5 mg）；生理盐水（广东科伦药业有限公司出产，国药准字号H20045198，批号D12070311-2，标准：500 ml∶4.5 g）；青霉素（广州白云山天心制药股份有限公司出产，国药准字号H20013260）；麻醉剂3.5%水合氯醛（天津科密欧化学试剂有限公司出产，批号20110514）。
1.1.3 试剂仪器 血清钙（Ca）、磷（P）、ALP试剂盒（批号：20130708、20131016、2130915，由南京建成生物技术公司供给）；血清BGP放免试剂盒（购自北京原子高科股份有限公司，批号：201311）。试验仪器：日立7600全自动生化仪；离心机（类型：TDZ5-WS，长沙普通仪器有限公司）；XH6080型放免仪（西安核仪厂）；双能X线仪DEXA（LUNAR-DPXIQ型，美国GE Lunar公司）；骨折造模支架参照相关文献[3]克己。
1.2 办法
1.2.1 建模办法 将试验动物随机分为根底组、模型组及医治组各16只。每周称体质量1次，并按体质量调整给药剂量。根底组：肌内打针生理盐水1 ml/（kg·d），3次/周，8周后手术构成大鼠右侧股骨骨折，骨折处选用金属内固定，术后3 d惯例抗感染处理，每日肌内打针1 000 000 U青霉素。术后第2天开端给予蒸馏水10 ml/kg灌胃，1次/d，继续8周。模型组：肌内打针地塞米松1 mg/（kg·d），3次/周，继续8周，仿制GIOP模型。8周末手术构成GIOP大鼠右侧股骨骨折，骨折处选用金属内固定，术后惯例抗感染处理同根底组，术后第2天开端给予蒸馏水10 ml/kg 灌胃，1次/d，继续8周。医治组：前8周GIOP骨折造模及骨折术后抗感染处理同模型组。骨折术后第2天以复骨方药液10 ml/kg灌胃给药，1次/d，继续8周。
1.2.2 骨折手术办法 使用3.5%水合氯醛（10 ml/kg）对试验大鼠进行腹腔麻醉，纵行切开右下肢髌骨内侧皮肤（长0.6～0.8 cm）及部分股四头肌腱性安排，将髌骨牵向外侧使之脱位，露出股骨髁间凹。用20号打针针自股骨髁间凹刺进髓腔扩髓，然后取出，再逆行刺进直径1 mm克氏针，从大转子及皮肤穿出，将内固定针远端埋于股骨髁间骨皮质下，近端紧贴大转子将尾部折弯，剩余部分剪除后闭合切断。将动物右下肢外展内旋位固定于造模支架的铁砧凹槽上（铁砧凹槽距离为15 mm），造模支架中柱下端的骨刀压于大鼠股骨中部，帮手提起500 g的砝码，从至20 cm高处将砝码自在落体撞向刀背，构成试验大鼠股骨中段闭合性骨折[3]。
1.2.3 血样本收集及血生化目标检测办法 试验8周末骨折手术前1天及试验12周末对3组动物采血。办法：以3.5%的水合氯醛溶液10 ml/kg腹腔打针麻醉，由腹主动脉取血，血样静置后2500 r/min离心20 min，别离出血清，置-40℃保存，依照试剂盒阐明使用全自动生化仪检测Ca、P和ALP含量，BGP活性选用放射免疫法检测。
1.2.4 骨密度测定 试验8周末对根底组和模型组的大鼠腹腔打针麻醉剂，选用双能X线吸收法（DEXA）以LUNAR-DPXIQ型骨密度仪及所顺便的小动物软件丈量大鼠活体全身骨密度，验证骨质疏松模型的树立是否成功。16周末打针麻醉剂，处死大鼠，在无菌条件下取双侧股骨，除掉附着安排，拔除克氏针，4℃避光保存在70%乙醇中，使用DEXA别离丈量右侧股骨全长骨密度及骨痂骨密度（骨痂中点上下10 mm处骨密度）。骨密度选用单位面积内的骨矿藏质含量表明（g/cm2）。
1.3 统计学处理
选用SSPS 12.0统计学软件处理数据，计量材料以均数±标准差（x±s）表明，选用t查验，以P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 试验大鼠骨密度的改动
试验8周末骨折术前，模型组大鼠骨密度值为（0.219±0.013） g/cm2，根底组骨密度值为（0.283±0.015） g/cm2，模型组骨密度值显着低于根底组，差异有统计学含义（t=12.8970，P<0.05），阐明GIOP模型仿制成功。试验16周末，医治组股骨全长骨和骨痂骨密度均高于模型组，差异有统计学含义（P<0.05）。模型组全长骨和骨痂骨密度均低于根底组，差异有统计学含义（P<0.05）（表1）。
表1 试验16周末3组大鼠股骨骨密度值的比较（g/cm2，x±s）
与根底组比较，t=11.2532，*P<0.05；t=13.7601，#P<0.05；与模型组比较，t=9.8403，△P<0.05；t=9.4618，▲P<0.05
2.2 试验中大鼠血清生化目标的改动
试验8周末，GIOP造模期，模型组、医治组大鼠血清Ca、P含量及ALP、BGP活性与根底组比较均显着下降（P<0.05）；试验12周末，医治组大鼠血清Ca、P含量及ALP、BGP活性与模型组比较均显着升高，差异有统计学含义（P<0.05）；模型组大鼠血清Ca、P含量及ALP、BGP活性显着低于根底组，差异有统计学含义（P<0.05）（表2）。
表2 试验中3组大鼠血清生化目标的比较（x±s）
与根底组对应时刻比较，*P<0.05；与根底组8周末比较，#P<0.05；与模型组12周末比较，△P<0.05
3 评论
糖皮质激素所构成的骨质疏松症是最常见的药源性骨质疏松[4]。美国国立卫生研讨院（NIH）将骨质疏松界说为一种以骨强度受损、骨折风险添加的骨骼疾病[5]，而骨强度是骨密度和骨质量的归纳反映。骨密度即单位骨面积所含的骨矿藏量，是反映骨强度与骨量的首要目标，是现在用于骨质疏松确诊、骨折风险度点评的重要目标[6]。本试验对大鼠肌内打针地塞米松8周后，模型组大鼠骨密度显着下降，血清生化查看提示模型组大鼠血清Ca、P含量及ALP、BGP活性与根底组比较均显着下降，模型组骨代谢出现一种低骨构成和高骨吸收的状况，阐明大鼠骨质疏松模型仿制成功，与国内相关研讨建模办法共同[7-9]。试验16周末，医治组股骨全长骨和骨痂骨密度均高于模型组，阐明复骨方医治可有用进步模型大鼠的骨密度，促进骨折的愈合。
骨折愈合是一个杂乱而接连的生物学修正进程，受许多要素的影响。血清ALP是成骨细胞分化的前期目标，是骨构成所必需的酶。ALP能分化有机磷酸化合物，促进无机磷酸盐离子与钙离子结组成磷酸钙而堆积于骨安排内，成骨细胞排泄的ALP可以进入血液，使血液ALP含量添加，ALP的活性常可提示骨折部分细胞增殖和活泼的程度，因而血清ALP可作为骨重建活泼性改动的标志，是一项调查骨折愈合的目标[10-11]。本试验GIOP造模期，模型组大鼠血清ALP与根底组比较显着下降，阐明糖皮质激素可使大鼠血清中ALP活性显着下降，然后按捺成骨细胞的效果，并加强骨吸收，导致骨质疏松。在人为骨折4周后，为骨重建期和骨塑形期。本试验挑选骨折术后经选用复骨方中药医治4周时采血测定血清生化目标，以调查中药对骨折骨重建期骨代谢的影响，成果显现医治组大鼠血清ALP活性显着高于模型组，由此可以估测，复骨方能进步骨折愈合重建时血清ALP的活性，增强骨折部位成骨细胞增殖，促进骨折愈合。复骨方由骨碎补、杜仲、续断、千年健、红花、归尾、川芎等组成，研讨发现[12]，骨碎补可能经过进步血钙、磷的浓度，促进钙、磷堆积，增强机体内成骨细胞增殖活动，进步血清ALP的活性然后促进骨折愈合。
正常的骨代谢进程是经过消化道的吸收和排泌、肾脏的滤过和重吸收、骨骼的矿化和再吸收三方面的调理。钙盐在骨中堆积和骨中钙盐溶解的正常进行是保持血液中钙磷含量安稳的重要环节，血液中钙磷含量的凹凸又直接影响骨的钙化和溶解。糖皮质激素可以下降肠钙吸收，并按捺肾钙的再吸收，影响骨的矿化。赵亮等[13]研讨发现，续断可进步骨折愈合中血清ALP的活性，升高钙磷堆积，促进骨构成。杜仲含有丰厚胶原、磷、钙盐等微量元素，能激活骨折愈合进程中相关细胞开释更多的ALP，进步血清ALP的活性，有利于骨质修正[14]。具有补肾壮骨成效的中药复骨方能进步模型大鼠血钙水平，有助于新骨的构成或钙化，并促进骨重建和骨折愈合。
BGP来源于骨安排，由成骨细胞组成并排泄到骨中，是骨安排中非胶原性蛋白的首要成分，约占骨质蛋白的3%，其效果是调理和保持骨钙[15]。部分BGP堆积于骨基质，部分进入血液循环，因而，血清中BGP浓度可特异性地反映成骨细胞的活性[16]。本试验成果显现，试验8周末，模型组大鼠血清中BGP的含量比根底组显着下降，阐明长时间使用糖皮质激素构成大鼠成骨细胞的活性显着下降，按捺骨构成。骨折术后，经过4周医治，医治组大鼠血清中BGP的含量挨近根底组，显着高于模型组，提示中药复骨方可以使成骨细胞的活性增强，促进成骨细胞组成和排泄BGP，促进骨折愈合。
综上所述，中药复骨方灌胃医治可显着进步GIOP骨折大鼠股骨骨密度，升高模型组大鼠血清Ca、P含量及ALP、BGP活性。中药复骨方经过升高血Ca、P促进新骨的构成或钙化，进步骨折愈合重建时血清ALP的活性，增强骨折部位成骨细胞的活性，促进成骨细胞组成和排泄BGP，进步GIOP骨折大鼠股骨骨密度，促进骨构成，有助于GIOP骨折的愈合。
[参考文献]
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[16] 孟昭亨.骨钙素及其临床含义[J].中华内排泄代谢杂志，1992，8（1）：41.
（收稿日期：2014-06-23 本文修改：郭静娟）
综上所述，中药复骨方灌胃医治可显着进步GIOP骨折大鼠股骨骨密度，升高模型组大鼠血清Ca、P含量及ALP、BGP活性。中药复骨方经过升高血Ca、P促进新骨的构成或钙化，进步骨折愈合重建时血清ALP的活性，增强骨折部位成骨细胞的活性，促进成骨细胞组成和排泄BGP，进步GIOP骨折大鼠股骨骨密度，促进骨构成，有助于GIOP骨折的愈合。
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（收稿日期：2014-06-23 本文修改：郭静娟）
综上所述，中药复骨方灌胃医治可显着进步GIOP骨折大鼠股骨骨密度，升高模型组大鼠血清Ca、P含量及ALP、BGP活性。中药复骨方经过升高血Ca、P促进新骨的构成或钙化，进步骨折愈合重建时血清ALP的活性，增强骨折部位成骨细胞的活性，促进成骨细胞组成和排泄BGP，进步GIOP骨折大鼠股骨骨密度，促进骨构成，有助于GIOP骨折的愈合。
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[16] 孟昭亨.骨钙素及其临床含义[J].中华内排泄代谢杂志，1992，8（1）：41.
（收稿日期：2014-06-23 本文修改：郭静娟）
