林蕤+顾卫+黄慧
[摘要]意图 评论特异乳酸杆菌（Lb-f）对人直肠癌裸鼠异种移植瘤模型癌细胞增殖的按捺效果。办法 选用小鼠背部皮下接种人直肠癌系（Colo320）细胞的办法树立裸鼠异种移植瘤模型，并随机分为五组，Ⅰ组作为模型对照组；Ⅱ～Ⅳ组别离以180、360、720 mg/kg的Lb-f灌胃，1次/d，灌胃2周。Ⅴ组腹腔打针化疗剂环磷酰胺100 mg/kg，1次/d，合计2周。使用MTT比色法和台盼蓝计数法测定各组的细胞增殖相对按捺率及成长按捺率，并取肿瘤安排，核算瘤重按捺率以及肿瘤成长按捺率，选用ELISA试剂盒测定Bax、Bcl-2、Caspase-3含量。效果 跟着干涉时刻的延伸，Colo 320瘤块体积有显着改变（P<0.01），且在开端的48 h内，体积增大不显着，48 h之后，体积增大状况较为显着。体外试验效果显现，各组的细胞增殖相对按捺率和成长按捺率比较，差异有统计学含义（P<0.01）；空白对照组和溶媒对照组的细胞增殖相对按捺率和成长按捺率比较，差异无统计学含义；其他组均较前两组高，且阳性药对照组为最高，其次是Lb-f 90组、Lb-f 60组、Lb-f 30组，各组之间的差异均有统计学含义（P<0.01或P<0.05）。在体试验效果显现，各组的细胞瘤重按捺率、肿瘤成长按捺率、肿瘤安排Bax含量、Bcl-2含量、Bcl-2/Bax、Caspase-3比较，差异有统计学含义（P<0.01或P<0.05）；细胞瘤重按捺率、肿瘤成长按捺率、肿瘤安排Bax含量按次序由低到高别离是Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组，Bcl-2含量、Bcl-2/Bax、Caspase-3按次序由低到高别离是Ⅴ组、Ⅳ组、Ⅲ组、Ⅱ组、Ⅰ组。定论 Lb-f可调理Bcl-2/Bax平衡，然后起到按捺肿瘤成长的效果，且呈剂量依赖性。
[要害词]直肠癌；裸鼠；异种移植瘤；特异乳酸菌
[中图分类号] R735.3+7 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）07（b）-0007-04
[Abstract]Oobjective To explore the inhibiting effect of Lactobacillus fermentum （Lb-f） to cancer cells proliferation of human colorectal cancer in nude mouse of xenograft tumor models.Methods The xenograft tumor models of human colorectal cancer in nude mouse were prepared by back subcutaneous injecting Colo320 in mice，and all the models were randomly divided into 5 group，Group Ⅰ was the control group，Group Ⅱ-Ⅳ were gavaged with Lb-f of 180，360，720 mg/kg respectively，one time every day for two weeks，and Group Ⅴ was given intraperitoneal chemotherapy cyclophosphamide of 100 mg/kg，one time every day for two weeks.Cell proliferation inhibition rate and growth inhibition rate among each group were detected using MTT colorimetry and trypan blue counting method.Further more，tumor tissues were extracted to calculate tumor inhibition rate and growth inhibition rate，and the content of Bax，Bcl-2，Caspase-3 was detected by ELISA kit.Results With the extension of intervention time，the volume of Colo320 tumor block was significantly changed （P<0.01），and in the beginning of 48 hours，the volume increase was not obvious，after 48 hours，the volume increase was more obvious.In vitro experimental results showed that the relative cell proliferation inhibition rate and the growth inhibition rate in each group was compared，and the difference was statistically significant （P<0.01）.There was no statistical difference between the blank control group and the solvent control group，and the other groups were all higher than that the control group and the solvent group，in which the positive control group was the highest，followed by Lb-f 90 group，Lb–f 60 group，Lb-f 30 group，the difference between erery group was statistically significant （P<0.01 or P<0.05）.In vivo experiment results showed that there was significant difference in the cell tumor inhibition rate，tumor growth inhibition rate，tumor tissue Bax content，Bcl-2 content，Bcl-2/Bax，Caspase-3 between every group （P<0.01 or P<0.05）.The tumor inhibition rate，tumor growth inhibition rate，tumor tissue Bax content in order from low to high respectively was groupⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，and the Bcl-2 level，the Bcl-2/Bax，Caspase-3 in order from low to high respectively was groupⅤ，Ⅳ，Ⅲ，Ⅱ，Ⅰ.Conclusion Lb-f is able to adjust colorectal antiapoptotic/apoptosis factors （Bcl-2 / Bax） balance，which contributes to the inhibiting of tumor growth，and inhibitory effect was dose-dependent.
[Key words]Colorectal cancer；Nude mice；Xenograft tumor；Lactobacillus fermentum
直肠癌（carcinoma of rectum）是消化道最常见的恶性肿瘤之一，因为方位低，易被直肠指诊及乙状结肠镜确诊[1-3]。本病具有方位深化盆腔、解剖联系杂乱、手术不易完全、术后复发率高级特色和难点，近年来发病率逐年增高，且青年人发病率有升高的趋势。现在，临床首要选用手术、放化疗以及免疫医治等归纳医治手法进行医治，常用的化疗药物存在选择性低、效果欠佳、毒性较大和易发作耐药性等缺陷[4-5]，因而寻觅选择性较高、对正常细胞毒性较低的药物已经成为新的发展方向。特异乳酸杆菌（Lactobacillus fermentum，Lb-f）是乳酸杆菌中的一种，有文献标明其对机体有免疫调理效果，这可能与其医治某些疾病存在相关性，并且Lb-f对人结肠癌存在按捺功用。本研讨根据人直肠癌裸鼠异种移植瘤模型医治试验对Lb-f抗人直肠癌的效果进行点评，得到了一些有用数据和定论。
1材料与办法
1.1材料
体外培育人直肠癌细胞系Colo320细胞，人直肠癌异种移植瘤骤变系BALB/c-nu雌性裸小鼠120只。
1.2办法
1.2.1造模和分组
试验模型：①体外培育人直肠癌细胞系Colo320细胞，用含小牛血清的RPMI-1640培育液37℃恒温培育，CO2浓度5%；当细胞涨势杰出，铺满整个瓶壁后，胰蛋白酶消化，进行传代培育，对数成长期用于试验。②调整Colo320细胞浓度1×107/ml，接种于小鼠背部皮下，游标卡尺丈量瘤体长、短径，核算初始体积。
1.2.2细胞增殖按捺率和细胞成长按捺率
1.2.2.1体外试验 按1×103/孔接种于96孔板中，选用MTT比色法测定细胞增殖相对按捺率（IR%），IR%=（1-试验组A均值/对照组A均值）×100%，其间A为吸光度；选用台盼蓝活细胞计数法测定细胞成长按捺率。体外试验分组如下：调零组（不加MTT）；空白对照组（等量PBS液）；溶媒对照组（0.2% DMSO）；阳性药物对照组（CTX 20 μg/ml）；Lb-f 30组（30 μmol/L）；Lb-f 60组（60 μmol/L）；Lb-f 90组（90 μmol/L）；每组10孔，效果48 h后进行目标测定。
1.2.2.2在体试验 除掉接种不成功者及体重过小或过大者，归入100只小鼠进行试验研讨，根据体重将其随机分为5组，每组20只。Ⅰ组：荷瘤BALB/c-nu对照组（NS 0.1 ml/10 g）；生理盐水灌胃，与Ⅱ～Ⅳ组同步。Ⅱ～Ⅳ组：Lb-f试验组（Lb-f 180、360、720 mg/kg）；用生理盐水别离装备180、360、720 mg/kg的Lb-f溶液进行灌胃，每天晨8时，灌胃2周。Ⅴ组：化疗剂环磷酰胺阳性药对照组（CTX）；腹腔打针100 mg/kg，1次/d，合计2周。末次给药或灌胃24 h后脱颈椎处死小鼠，调查瘤体积和瘤重，核算瘤重按捺率和肿瘤成长按捺率。瘤体积：V=L×W2×0.52；瘤重按捺率（%）=（1-试验组瘤重均值/对照组瘤重均值）×100%；肿瘤成长按捺率（%）=（1-试验组瘤体积均值/对照组瘤体积均值）×100%。
1.2.3细胞增殖的生物学目标
Ⅰ～Ⅴ组取出的瘤体安排，参加9倍分量的生理盐水，电动匀浆器匀浆，装备为10%的匀浆液，以ELISA试剂盒和全自动生化剖析仪测定B细胞淋巴瘤因子相关x蛋白（Bax）、细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）的含量。ELISA试剂盒均由上海拜力生物科技有限公司供给。
1.3统计学处理
选用SPSS 19.0软件对数据进行统计剖析，计量材料以x±s标明，选用t查验，计数材料选用χ2查验，以P<0.05为差异有统计学含义。
2效果
2.1 Colo 320瘤块接种裸鼠直肠黏膜后肿瘤体积的比较
跟着干涉时刻的延伸，Colo320瘤块体积有显着改变（P<0.01），且在开端的48 h内，体积增大不显着，48 h之后，体积增大状况较为显着（表1）。
2.2各组体外细胞增殖相对按捺率及成长按捺率的比较
体外试验效果显现，各组的细胞增殖相对按捺率和成长按捺率比较，差异有统计学含义（P<0.01）。空白对照组和溶媒对照组的细胞增殖相对按捺率和成长按捺率比较，差异无统计学含义，其他组均较前两组高，且阳性药对照组为最高，其次是Lb-f 90组、Lb-f 60组、Lb-f 30组，各组之间的差异均有统计学含义（P<0.01或P<0.05）（表2）。
2.3各组在体细胞瘤重按捺率以及肿瘤成长按捺率的比较
在体试验效果显现，各组之间的细胞瘤重按捺率以及肿瘤成长按捺率比较，差异有统计学含义（P<0.01或P<0.05），按次序由低到高别离是Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组（表3）。
2.4各组肿瘤安排Bax、Bcl-2、Bcl-2/Bax、Caspase-3含量的比较
在体试验效果显现，各组之间的肿瘤安排Bax含量比较，差异有统计学含义（P<0.01），按次序由低到高别离是Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组。各组之间的Bcl-2含量比较，差异有统计学含义（P<0.01），按次序由低到高别离是Ⅴ组、Ⅳ组、Ⅲ组、Ⅱ组、Ⅰ组。各组之间的Caspase-3含量比较，差异有统计学含义（P<0.01），按次序由低到高别离是Ⅴ组、Ⅳ组、Ⅲ组、Ⅱ组、Ⅰ组（表4）。
3评论
直肠癌是指处于齿状线到乙状结肠和直肠相交方位之间的癌症[6-8]。在消化道的癌症中，肠癌的发病率仅低于胃癌，约占胃肠道癌症的25.9%，而坐落直肠肛管癌中腹膜反折以下的直肠，是癌肿的多发方位，约占75%。前期直肠癌患者在临床上常无症状或症状并不特异，因而无法引发患者以及初度诊治医生的注重。许多患者在发病前期伴有排便习气发作改变以及便血的现象，呈现便频以及排便不尽感。便频和腹泻存在不同，便频仅仅是指次数比正常人多，可是排出粪便的性状无反常或许无较大改变；排便不尽感是指患者排便之后不久又呈现便意，但无粪便排出或许是仅排出少数粪便，且间有少许黏液血便，常不引起患者留意。本病一旦发病，将对患者的身心发作必定程度的影响。
直肠癌方位深化到患者盆腔，解剖联系较为杂乱，手术难以做到完全清除，术后的复发概率较高[9-10]。惯例化疗药物的选择性低，效果欠佳，毒性较大，易发作耐药性，因而，发现并开发对直肠癌肿瘤细胞选择性较高、对正常细胞毒性较低的药物火烧眉毛。近年来，因为医学微生态学的不断发展，微生态制剂作为免疫赋活剂已经在防治病症方面获得了较为可喜的效果。乳酸杆菌作为新式生物反响调理剂，具有多种药理效果，详细如下：①黏附于细胞；②具有多种抗肿瘤效果；③安全、无侵袭性、无致癌性、无致病性等。有文献报导显现，乳酸杆菌能削减结肠癌的发作，具有抗骤变的效果，能够促进凋亡。Lb-f是乳酸杆菌中的一种，有文献标明其对机体有免疫调理效果，对人结肠癌存在按捺功用。本研讨从乳酸杆菌中挑选出Lb-f作为研讨目标，点评Lb-f医治人直肠癌的有用性，旨在为临床使用Lb-f医治直肠癌供给根据，因而具有宽广的临床使用远景。本研讨效果显现，Colo320瘤块接种裸鼠直肠黏膜后肿瘤体积在开端的48 h内无显著性添加现象，体积增大较为显着发作在48 h之后；试验组的细胞增殖相对按捺率以及成长按捺率显着高于Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组及Ⅳ组，差异有统计学含义；试验组的细胞瘤重按捺率以及肿瘤成长按捺率显着高于Ⅰ组和Ⅱ组，差异有统计学含义，提示Lb-f对人直肠癌具有必定的按捺效果。Caspase-3是介导细胞凋亡的要害履行分子，在凋亡信号传导途径中发挥重要效果，被称为“逝世蛋白酶”，是细胞凋亡的生物学标志[11-14]。抗凋亡的Bcl-2和促凋亡的Bax是调控细胞凋亡的Bcl-2蛋白宗族的重要成员，Bcl-2/Bax的比值与肿瘤凋亡密切相关，决议了促凋亡因子Caspase-3的激活程度[15-19]。本研讨中，细胞瘤重按捺率、肿瘤成长按捺率、肿瘤安排Bax含量按次序由低到高别离是Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组，Bcl-2含量、Bcl-2/Bax、Caspase-3按次序由低到高别离是Ⅴ组、Ⅳ组、Ⅲ组、Ⅱ组、Ⅰ组，提示Lb-f对人直肠癌按捺呈剂量依赖性。
综上所述，Lb-f对人直肠癌有按捺效果，且呈剂量依赖性，本研讨为临床开发低毒增效的药物（Lb-f）供给了理论和试验根据。
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（收稿日期：2016-02-29 本文修改：祁海文）
