支钦+李新宇+姚志勇
[摘要] 意图 制备注射用醋酸艾塞那肽缓释微球，以到达缓释效果，然后削减用药次数。 办法 以聚乳酸-羟基乙酸为载体，羧甲基纤维素钠水溶液为涣散介质，乙酸乙酯为有机溶剂，甘露醇为维护剂，经过复乳-液中枯燥法和冷冻枯燥法制备注射用醋酸艾塞那肽缓释微球。以微球收率、粒径、包封率为目标，选用正交实验法来优化微球的处方和制备工艺。选用透析法调查含药微球的体外释药特性，核算微球累积释药百分率，制作体外释药曲线。 成果 经过正交规划筛选出制备注射用醋酸艾塞那肽缓释微球的处方和制备工艺，载药量为21.3%，包封率为94.6%，Zeta电位为（-29.3±1.51）mV，含药缓释微球的体外释药进程契合Higuchi方程。 定论 制备的注射用醋酸艾塞那肽缓释微球具有30 d的缓释效果。
[关键词] 醋酸艾塞那肽；缓释微球；体外开释
[中图分类号] R943.41 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）09（c）-0010-04
Study on the preparation and release in vitro of Exenatide Acetate Sustained-releasing Microspheres for injection
ZHI Qin LI Xin-yu YAO Zhi-yong
Shenzhen JYMed Technology Co.，Ltd.，Shenzhen 518057，China
[Abstract] Objective To prepare Exenatide Acetate Sustained-release Microspheres to realize the sustained-release effect and reduce the frequency of drug use. Methods Exenatide Acetate Sustained-release Microspheres were prepared by the method of double-elusion drying in liquid with PLGA as the carrier，ethyl acetate as the organic solvent，CMC-Na water solution as the dispersion medium and mannitol as the diluents and the method of freezing drying.The prescription and preparation process were optimized by orthogonal test with particle size，yield and encapsulation as the investigating index.The property of releasing drug in vitro was investigated by the method of dialysis.The cumulative drug-releasing percentage of Sustained-release Microspheres was calculated and the drug-releasing curve was drawn. Results The prescription and preparation process were screened according to the orthogonal test with a drug loading capacity of 21.3%，an encapsulation efficiency of 94.6% and a Zeta potential of （-29.3±1.51） mV.The releasing profile in vitro was in accordance with Higuchi equation. Conclusion The Exenatide Acetate Sustained-release Microspheres for injection have releasing effect of 30 days.
[Key words] Exenatide Acetate；Sustained-release Microspheres；Release in vitro
艾塞那肽最先是从大毒蜥的唾液排泄物中分离出来的含有39个氨基酸的天然肠促胰岛素类似物，能模仿胰高血糖素样肽-1（GLP-1）的效果，然后到达操控血糖的效果。人工组成的艾塞那肽是首个获准上市的肠促胰岛素类似物，体外研讨显现，该化合物能够结合、活化人体GLP-1受体，经过cAMP或其他细胞内信号传导机制来添加葡萄糖依赖性胰岛素的组成或添加胰岛素在体内的排泄，临床上首要用于改进二甲双胍和磺酰脲类药物医治不抱负的2型糖尿病患者的血糖操控，还具有心血管维护效果[1-6]。聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）是一种高分子资料，它由乳酸和羟基乙酸聚合而成，具有生物相容性的，可在体内降解[7-9]。在人体，艾塞那肽半衰期较短，为延伸其效果时刻，削减患者的用药次数，下降血药浓度峰谷动摇，添加患者的顺应性，本研讨将该药物制备成缓释微球，使之具有缓释效果[10]，并调查其包封率、载药量和体外释药特性。
1 仪器与资料
1.1 仪器
FJ200-T守时高速涣散均质拌和机（深圳市鼎鑫宜实验设备有限公司），XS64电子天平（十万分之一，梅特勒-托利多），e2695高效液相色谱仪（2998型紫外检测器，美国Waters公司），Perkinelmer Clarus 500型气相色谱仪（PE公司），S-205D超声波脆碎仪（Harvard Apparatus），LG-J型冷冻枯燥机（北京四环科学仪器厂），JSM-5600LV型扫描电子显微镜（SEM）（日本电子光学公司），高灵敏度Zeta电位及激光粒度剖析仪[Zeta phase analysis light scattering（PALS）型，美国布鲁克海文仪器公司]。
1.2 资料
乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA，25 000，85∶15，我国科学院成都有机化学有限公司，批号：130411，药用级），醋酸艾塞那肽（克己，纯度为98%），羧甲基纤维素钠（CMC-Na，天津爱乐易医药资料有限公司，批号：1305206，药用级），甘露醇（广东新宁制药厂，批号：131003，药用级），乙酸乙酯（南京化学试剂股份有限公司，批号：130233，药用级）。
2 办法与成果
2.1 处方优化
经过复乳-溶剂蒸发法制备醋酸艾塞那肽缓释微球[11-12]。在预实验的基础上，得出对微球性质影响较为显着的4个要素，别离为涣散介质（CMC-Na）的浓度、拌和速度、PLGA的浓度及投料比。按L9（34）正交表中的4要素、3水平来规划实验，对4个要素进行调查（表1）。
表1 醋酸艾塞那肽缓释微球L9（34）正交表要素及水平
以微球包封率（Q1）、收率（Q2）和粒径落在20～50 μm的百分数（Q3）为目标进行归纳点评（Q），Q= Q1+Q2+Q3。其间Q值越高，实验条件越好。实验计划和成果见表2。
表2 醋酸艾塞那肽缓释微球L9（34）正交实验办法及成果
从表2的直观剖析成果能够得出，4个要素对缓释微球质量的影响程度的次序为：A>B>C>D，然后得出最佳化处方为A3B1C1D3，即药物-PLGA质量比为1∶5，油水份额为1∶3，PLGA的浓度为0.1 g/ml、涣散介质CMC-Na的浓度为0.4%。
2.2 缓释微球的制备办法
经过复乳-液中枯燥法制备含药缓释微球[13-14]。其制备办法为：将66.7 mg药物参加到6 ml的蒸馏水中，得水相；取PLGA 200 mg，用2 ml的乙酸乙酯溶解，得油相；水相、油相均超声6 min，至溶解。将上述水相参加油相，运用超声波脆碎仪进行乳化涣散，得初乳，然后将初乳缓慢参加到40 ml的CMC-Na溶液中（浓度为0.1%），运用均质拌和机以2000 r/min进行乳化涣散，得W/O/W型复乳；将此复乳继续拌和3～4 h，蒸发除掉有机溶剂，经过滤之后，搜集固化的载药微球，用蒸馏水洗刷微球，分3次进行，弃去滤液，得到含药微球；制造必定浓度的甘露醇溶液，将微球参加其间，冷冻枯燥，即得注射用含药微球。
2.3 缓释微球的粒径散布和Zeta电位的测定
用SEM调查上述醋酸艾塞那肽缓释微球的外观和形状，镜下可见所制备的微球均呈圆球状，且巨细均匀、规整（图1），微球的粒径平均值为34.6 μm，粒径规模为20～50 μm的微球量占总微球量的79.6%（图2）。选用Zeta电位剖析仪测定缓释微球的Zeta电位，成果显现微球的Zeta电位值为（-28.3±1.51）mV，其外表所带电荷为负电荷。
图1 醋酸艾塞那肽缓释微球的Zeta电位扫描图
图2 醋酸艾塞那肽缓释微球的粒径散布图
2.4 醋酸艾塞那肽缓释微球的体外开释
2.4.1 色谱条件 色谱柱：TSK Gel G2011SW柱（300 mm×7.5 mm）；活动相：水-乙腈-0.15 mol/L枸橼酸-三氟乙酸（体积比20∶75∶5∶0.2）；检测波长：217 nm；柱温：25℃；流速：0.8 ml/min；进样量：20 μl[15]。
2.4.2 含量测定 取8 mg的上述含药微球，精细称定，参加2 ml乙酸乙酯使其溶解，参加2 ml蒸馏水提取微球中药物，重复3次进行提取。将3次所得提取液进行涡旋、离心，最终兼并上清液。取上清液1～10 ml容量瓶中，用蒸馏水定容，即为待测样品。参照“2.4.1”项下办法对待测样品进行相关测定，以载药量=药物含量/微球分量核算载药量，以包封率=药物含量/投药量核算包封率，成果载药量为21.3%，包封率为94.6%。
2.4.3 含药缓释微球体外释药及释药成果模型拟合 精细称取上述缓释微球，每份5 mg，置于20个别积为10 ml的西林瓶中，每份中参加含有0.1 mol/L的Na2HPO4和0.1 mol/L的NaH2PO4的pH为7.4的缓冲溶液，参加体积为8 ml，将西林瓶静置于37℃恒温水浴中，在第0、1、5、10、15、20、25、30天8个时刻点别离取样并按“2.4.1”项下办法测定，核算含药微球的累计开释度[16-17]，并依据开释成果制作释药曲线（图3）。选用模型拟合释药，成果显现，Higuchi模型拟合方程为M=0.183t1/2+0.036，一级释药模型拟合方程为ln（1-M）=-0.048t+2.199，零级释药拟合方程为M=0.030t+0.210，三者的r2别离为0.991、0.808、0.904。鉴于相关系数越挨近1，拟合效果越好，本研讨成果提示，在这3种拟合模型中，经过Higuchi方程的拟组成果最好。
图3 醋酸艾塞那肽缓释微球体外释药曲线
2.5 残留溶剂的测定
选用气相色谱法对微球中的乙酸乙酯残留量进行测定。其色谱条件为：HP-INNOWAX毛细管柱（30 m×0.53 mm×1 μm），以氮气为载气，流速为1.0 ml/mim；柱温选用程序升温：初始温度为50℃，坚持10 min后以6℃/min升温至120℃，坚持5 min，再以40℃/min升温至200℃，坚持2 min；氢火焰离子化检测器（FID），进样口及检测器温度均为250℃；于80℃将供试品平衡25 min，汲取顶空进样瓶的上部气体进跋涉样，汲取体积为1 ml；分流比为10∶1[18-19]。
取上述醋酸艾塞那肽缓释微球100 mg，精细称定，加二甲基亚砜溶解至3 ml，置顶空瓶中，按上述色谱条件进行测定。成果显现，微球中乙酸乙酯残留量为0.27%，在《我国药典》规则的极限0.5%以内。
3 评论
缓释微球的载体资料可直接影响微球的各项功能。近几年，具有生物可降解特性的高分子资料遭到高度重视，而在这类生物可降解资猜中，聚酯类是至今停止被研讨最多且使用最为广泛的高分子资料，它们大多数是由羟基酸或其内酯聚合而成。在这个进程中，羟基乙酸和乳酸为常用的羟基酸，详细包含聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物、聚3-羟基丁酸酯、丙交酯-乙交酯共聚物、聚乳酸等，它们均具有成膜性及成球性好、无毒、化学安稳性高级特色，别的还可注射给药。
乳化-溶剂蒸发法是制备PLGA微球常用办法之一。选用复乳-液中枯燥法制备缓释微球，在制备进程中对温度要求低，可削减因为高温导致的PLGA降解，且选用此办法对遇热不安稳的蛋白质以及多肽类药物可起到必定的维护效果。
PLGA的浓度、拌和速度、投药量、油水份额、温度、乳化剂浓度等要素均可影响微球的成形性。在PLGA对缓释微球影响的调查进程中发现，微球的包封率跟着PLGA质量分数的增大而增大，PLGA质量分数对微球粒径也有相同的影响；别的，粒径尽管受温度的影响不大，但温度却能够较显着地影响微球的包封率，因而为了进步包封率，能够恰当进步温度，可是考虑到主药的安稳性问题，温度不行过高。
载体资料PLGA在体内降解的机制为本体溶蚀，这种降解机制导致基质内部聚合物的降解速度等于乃至快于基质外表的聚合物，除此之外，PLGA的分子量、聚合单体摩尔比以及散布状况也是影响其降解和缓释功能的首要要素。一般，跟着PLGA中羟基酸份额的添加，微球的溶蚀速度会加速，微球中药物的开释速度也加速，尤其是当乳酸与羟基乙酸的摩尔份额为50∶50时，PLGA的降解速度到达最快；在分子量散布规模较窄的PLGA中，较少的羧基端基可用于本身催化，因而聚合物的降解速度也相对较缓慢，反之，分子量散布规模较宽的PLGA则降解较快。
缓释微球中，药物在微球中的所在部位和载体的性质很大程度上决议药物的开释特性。药物既能够被吸附在微球的外表也能够被彻底包封在微球中，还能够散布在表层和空地中，不同部位的药物开释速度不同，未被彻底包封于微球中的药物，能够较快地开释出来，无需待载体资料降解之后才从微球中开释出来。本办法制备的载药缓释微球，可完成继续、安稳开释药物，其体外开释成果契合Higuchi方程。其开释期长达30 d，然后削减用药次数。
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（收稿日期：2015-05-22 本文修改：卫 轲）
