潘洁雪+叶龙云
[摘要] 意图 探究上皮型卵巢癌细胞卡铂耐药的机制，为前进卵巢癌患者化疗效果供给前期根底。 办法 运用CCK8办法检测卵巢癌细胞对卡铂的IC50浓度，用Western blot办法检测卡铂处理后细胞上皮间质化改变（EMT）蛋白E-Cadherin和Vimentin表达状况，运用siRNA敲降AQP3后再调查卡铂对其效果。 成果 卵巢癌细胞系SKOV3与A2780的卡铂IC50别离为2.814 μg/mL与1.516 μg/mL，一起发现卡铂能诱导卵巢癌细胞发作EMT，基因芯片成果显现水通道蛋白AQP3显着上调，进一步敲降AQP3基因后，能显着削弱卡铂诱导卵巢癌细胞发作EMT的效果。 定论 AQP3在卵巢癌细胞卡铂耐药机制中具有重要效果，下降AQP3的表达能够削弱卡铂诱导卵巢癌细胞上皮间质化改变的效果。
[要害词] 卵巢癌；卡铂；上皮间质化改变；水通道蛋白
[中圖分类号] R737.31 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）15-0027-03
[Abstract] Objective To discuss the mechanism of carboplatin resistance in epithelial ovarian cancer cells and to provide basis for improvement of chemotherapy effect in patients with ovarian cancer. Methods The IC50 concentration of ovarian cancer cells towards carboplatin was detected by CCK8， the expression of EMT proteins E-Cadherin and Vimentin after management of carboplatin was detected by Western blot， and the effect of carboplatin was observed again after AQP3 was knocked down by siRNA. Results The carboplatin IC50 was 2.814 μg/mL in SKOV3 ovarian cancer cell line and 1.516 μg/mL in A2780 line. Carboplatin could induce EMT in ovarian cancer cells. As to the result of gene chip， AQP3 was significantly up-regulated. When AQP3 gene was knocked down， EMT effect induced by carboplatin in ovarian cancer cells could be significantly reduced. Conclusion AQP3 has significant effect in the mechanisom of carboplatin resistance in ovarian cancer cells and reduction of the expression of AQP3 can reduce the EMT effect in ovarain cancer cells.
[Key words] Ovarian cancer； Carboplatin； Epithelial-mesenchymal transition； AQP
上皮型卵巢癌是女人生殖器最为常见的恶性肿瘤之一[1]，虽然近年来对卵巢癌的医治，包含手术、放化疗及靶向医治已经有了长足的前进，但卵巢癌患者预后仍较差，其间化疗耐药导致卵巢癌患者化疗效果差、前期复发搬运是重要要素之一[2]。化疗在卵巢癌患者术后归纳医治中有着无足轻重的位置，铂类为根底的化疗计划是卵巢癌患者的一线医治计划，可是大多数患者在阅历了几个医医治程后会发作耐药，尤其是对常用的化疗药卡铂耐药[3]。因而为了进一步前进卵巢癌患者彻底治愈术后的生存率，前进现有化疗药物的效果是医治要害。但对卡铂化疗耐药更深化的机制仍不清楚，具有局限性，因而进一步研讨卵巢癌内涵调控化疗耐药的分子信号途径，寻觅新的化疗药物，反转现有的化疗耐药现状为咱们拟定新的卵巢癌医治政策供给了重要思路。
水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）广泛参加人体细胞内各种生理活动，在细胞膜上广泛散布，在哺乳动物中总共有13种AQP（AQP 0～12）[4]，而其间，AQP3被以为能够使细胞侵袭才能增强[5]，可是在卵巢癌中的研讨尚属空白，基于此，本文调查AQP蛋白在卵巢癌中的效果，为进一步处理卡铂耐药奠定研讨根底。
1 资料与办法
1.1 细胞培育
人卵巢癌细胞株A2780和SKOV3购自我国科学院上海生物科学研讨院。运用RPMI-1640培育基，其间胎牛血清浓度为10%、1%青霉素/链霉素，均来自Gibco公司。细胞在37℃和5%CO2的条件下培育。
1.2 细胞活性检测
选用Dojindo公司CCK8试剂盒，检测细胞的活性。将细胞种在96孔培育板后，待细胞贴壁，别离参加指定的卡铂浓度，并培育48 h，参加CCK8试剂，并于490 nm处测OD值。
1.3 Real-time PCR 检测细胞AQP3的表达
别离提取对照组与卡铂组卵巢癌细胞的RNA，选用SYBR Premix Ex Taq Kit （TAKARA公司）进行Real-time PCR 检测AQP3的表达，将意图基因与内参基因的CT值比较（△CT）后，再将卡铂组与对照组比较（△△CT）。
1.4 Western blot检测E-Cadherin、Vimentin、AQP3蛋白水平
RIPA裂解细胞，提取蛋白，运用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳别离蛋白，随后运用湿转法，将蛋白转到PVDF膜。之后关闭洗过，用E-Cadherin（CST，1∶1000）、Vimentin （CST，1∶1000）、AQP3（Abcam，1∶500）与GAPDH（CST，1∶2000）等一抗4℃过夜。取出膜，运用TBST液洗刷，再运用相应的二抗4℃孵育2 h。运用化学发光法检测印迹。运用Quantity One软件进行条带灰度定量。
1.5基因芯片
将细胞提取RNA送上海康成生物公司，运用Agilent表达谱基因芯片进行剖析。
1.6统计学剖析
核算和剖析运用Graph Pad Prism 6软件，选用两个独立样本均数的t查验进行剖析比较。P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 卵巢癌细胞系在卡铂效果下发作EMT
首要检测在SKOV3与A2780两个卵巢癌细胞系中卡铂的IC50，别离为2.814 μg/mL与1.516 μg/mL（封三图1A），发现卡铂细胞显着诱导卵巢癌细胞系EMT，其E-Cadherin蛋白显着下调，而Vimentin蛋白显着上调（封三图1B与封三图1C），灰度定量提示其具有显着统计学差异，因而以为卡铂具有诱导卵巢癌细胞系发作EMT的才能。
2.2 水通道蛋白在卡铂诱导的EMT中的效果
进一步探究水通道蛋白AQP在卡铂效果下卵巢癌细胞系中的效果，运用基因芯片筛查水通道蛋白的改变，发现在水通道蛋白里，AQP 1、6、10、12a根本不变，而AQP 2、9、11表达稍有下降，而AQP 3、4、5、7、8表达上调，在这其间AQP3显着上调（封三图2A）。进一步运用Western blot在蛋白水平断定了AQP3在卡铂效果下的上调趋势（封三图2）。
2.3 敲降AQP3能按捺卡铂诱导的卵巢癌细胞系的EMT效果
进一步运用AQP3 siRNA敲降AQP3在卵巢癌细胞中的表达，并与卡铂联合效果，发现卡铂诱导卵巢癌细胞系构成EMT的效果被AQP3 siRNA显着削弱，卡铂不能诱导卵巢癌细胞系的EMT表型发作，搅扰AQP3后，Vimentin表达较卡铂效果显着下降，E-Cadherin则显着上调（封三图3A与封三图3B）。因而揣度，卡铂诱导卵巢癌细胞系构成EMT的效果有可能是经过AQP3这条通路。
3评论
卵巢癌是女人生殖体系常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着女人的生命健康，其在全球女人患者的逝世原因中占第七位[6]。据报道，卵巢癌在美国将近有22 280例的新发病例，以及14 240例的逝世人数[6]，而我国卵巢癌患者的发作率以及逝世率也显着上调，其逝世率到达3.31/10万[7]。卵巢癌患者术后化疗的一线用药以卡铂为根底，铂类药物被广泛用于全身各个脏器的上皮性恶性肿瘤中，包含膀胱癌、睾丸癌、肺癌、卵巢癌、胃癌等[8]。卵巢癌患者化疗耐药导致的术后复发搬运与其预后较差相关，因而卵巢癌患者耐药问题亟待处理。
铂类化疗药物耐药触及多种机制，包含DNA修正体系反常、机体对铂类-DNA复合物的耐药性增强、肿瘤血流反常、铂类药物吸取下降和排出增快、抗凋亡因子上调、肿瘤细胞发作EMT改变，以及多种耐药相关蛋白上调等，而在这其间EMT改变被以为在肿瘤细胞铂类耐药进程中占有重要效果[9-11]。EMT在乳腺癌、肺癌、肠癌与胰腺癌等肿瘤耐药中起重要效果[12-15]。在EMT进程中，肿瘤细胞损失上皮细胞特色而转向间质性细胞，进而具有更强的侵袭与搬运才能，而且具有更强的耐药特性，而其机制没有清晰。本文发现卡铂在处理卵巢癌细胞后发作显着的EMT改变，E-Cadherin表达下调，Vimentin表达上调。
水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）广泛散布在机体的细胞膜上，在哺乳动物中总共有13种水通道蛋白（AQP 0～12）[4，16]。AQP3在人体中广泛散布于肾调集管、上皮安排、结膜与乳腺中。据报道AQP3蛋白能够经过对水与甘油的转运然后构成细胞伪足，促进细胞侵袭[17-19]，AQP3缺点的老鼠可表现为尿液浓缩功用障碍、皮肤愈合功用障碍以及消化道功用反常。而AQP3的功用反常高表达，则有可能促进肿瘤发作与开展[20]。本文从水通道蛋白（AQPs）下手，广泛筛查AQP蛋白在卡铂效果下的耐药特色，进而发现AQP3在卡铂诱导EMT的进程中起重要效果，而且咱们进一步敲降AQP3，发现能反转卡铂引起的EMT进程。
综上，咱们以为卡鉑可能是经过AQP3这条通路引起卵巢癌细胞EMT，进而引起卵巢癌细胞耐药，提示AQP3能够作为卵巢癌患者承受卡铂医治后的预后目标。这些成果可能提醒了一个处理卵巢癌细胞耐药的新通路，为进一步处理这个问题打下了根底，当然需求更进一步的研讨提醒AQP3与EMT相关蛋白间详细怎么效果。
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