郭伟 冯江敏 孙立等
[摘要] 意图 调查促红细胞生成素（EPO）对缓慢马兜铃酸肾病（CAAN）大鼠血管性假血友病因子（vWF）表达的影响，评论促红细胞生成素对缓慢马兜铃酸肾病大鼠的肾脏维护效果。办法 雌性Wistar大鼠30只，随机分三组：①CAAN模型组，②EPO医治组，③正常对照组，每组各10只，关木通水煎剂灌胃12周制备CAAN大鼠模型。从第13周起，医治组大鼠给予皮下注射重组人EPO每次50 IU/kg，每周3次，共6周。第19周检测各组大鼠血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）、尿蛋白、血红蛋白（Hb）、血vWF水平；免疫组化法检测肾安排vWF的表达。成果 与CAAN组比较，EPO医治组BUN、SCr、尿蛋白水平、vWF水平下降，Hb水平升高 （均P<0.05）。一起EPO医治组大鼠肾安排vWF的表达削减（P<0.05）。 定论 EPO医治能够改进CAAN大鼠的肾功能，可能与其下调vWF，减轻内皮危害有关。
[关键词] 促红细胞生成素；马兜铃酸；缓慢；大鼠；血管性假血友病因子
[中图分类号] R692 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）12-0008-03
[Abstract] Objective To observe the effect of erythropoietin on the expression of Von Willebrand factor（vWF） in CAAN rats and to investigate the protective effect of erythropoietin of kidney in rats with CAAN. Methods Thirty female Wistar rats were randomLy divided into 3 groups. ①CAAN group（n=10）； ②EPO group（n=10）； ③SHAM group（n=10）； CAAN group and EPO group were infused into stomachs with Caulis aristolochia manshuriensis decoction for 12 weeks. From week 13，EPO group were received EPO by hypodermic injection with 50 IU/kg three times a week for 6 weeks. At weeks 19，All the rats were killed. Specimens of blood and urine were collected to detect the blood urea nitrogen（BUN），Serum creatinie（Scr）， Haemato-globin（Hb），urine protein and levels of vWF. HE and Masson staining and micro-scopy were used to observe the pathology of the kidney. Immunohistochemistry were used to detect the expression of vWF. Results Urinary protein， serum creatinine and BUN and levels of vWF in EPO treated group were much lower than those of CAAN group； Hb was increased（both P<0.05）. The A value of vWF+ decreased in EPO treated group comparing to CAAN group（P<0.01）. Conclusion EPO could deduce the level of vWF and decreased thrombosis.
[Key words] Erythropoietin； Aristolochia acid； Chronic；Rat； Von Willebrand factor
马兜铃酸肾病（Arisolochic acid nephrapathy， AAN）是因为服用含有马兜铃酸（Arisolochic acid， AA）的中草药所造成的的肾小管间质疾病[1]。尽管对含 AA 中草药的肾毒性知道逐步提高，但研讨报导显现：在底层医院含 AA 药物的使用量仍在逐年添加。每年不断出现新发 AAN 病例快速开展至终晚期肾脏病（ESRD），给患者、家庭及政府带来沉重的医疗和经济负担[2-3]。现在对AAN的医治尚无老练办法。促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是主要由肾脏排泄的多肽细胞因子，是红细胞增殖、发育进程的重要调理因子[4]。跟着人们对 EPO 的生物学效应不断地深入研讨，EPO的非造血效果引起巨大重视。Jungers 等[5]的回忆性研讨发现 EPO 能够显着推迟缓慢肾病的开展。本研讨拟调查EPO对CAAN大鼠vWF表达的影响，评论EPO的肾脏维护效果。
1 材料与办法
1.1试验材料
雌性Wistar大鼠30只，体重190～220 g。购自沈阳药科大学试验动物中心。关木通购自辽宁省中医药大学。人重组EPO由华北制药金坦生物技术有限公司供给。Masson试剂盒购自福建迈新公司。兔抗大鼠vWF多克隆抗体购自丹麦Dako Cyto-mation公司、SABC即用型试剂盒、DAB显色试剂盒、二抗生物素化羊抗兔IgG购自武汉博士德公司。
1.2办法
1.2.1 动物模型制备及分组 参照文献[6]办法制备CAAN动物模型，关木通水煎剂灌胃12周，剂量20 g/（kg·d）相当于10 mL/（kg·d），试验期间大鼠均自在饮食，饮水。雌性Wistar大鼠30只，随机分为三组：CAAN模型组、EPO医治组、正常对照组，每组各10只，造模完毕后，医治组大鼠予皮下注射重组人EPO每次50 IU/kg，每周3次，共6周。
1.2.2 血、尿生化目标检测 邻苯三酚红钼络合法检测24 h尿蛋白定量，全自动生化剖析仪检测血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）。ELISA法检测外周血vWF含量。
1.2.3肾安排形态学查看 肾安排标本用4%多聚甲醛固定4 h，白腊包埋，切取4 μm白腊切片，HE和Masson染色，一般光镜调查。Masson染色纤维化区域染色呈兰色，每张切片随机选取10个不含肾小球的视界（400倍），用显微图象剖析仪测定其纤维化区域的积分光密度值（A），代表肾间质纤维化面积。
1.2.4 vWF免疫安排化学染色 4 μm白腊切片顺次经脱蜡，水化及抗原修正，正常山羊血清关闭非特异染色，滴加一抗兔抗vWF多克隆抗体，作业浓度为1∶500，PBS替代一抗为阴性对照。然后滴加二抗生物素化羊抗兔IgG，作业浓度为1∶150，37℃孵育20 min，DAB显色，苏木素复染；系列酒精脱水、通明、封片，镜下调查。用显微图象剖析仪对图画进行定量剖析。每张切片随机选取10个高倍视界（400倍），测定其阳性物质积分光密度（A）值。
1.3 统计学剖析
使用SPSS17.0统计学软件剖析处理，其间计量材料用均数±标准差（x±s）标明，组间差异比较选用单因素方差剖析，P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1血、尿生化查看成果
EPO组和CAAN组24 h尿蛋白定量、尿素氮和血肌酐、外周血vWF含量均较正常对照组显着升高，Hb显着下降；与CAAN组比较，EPO组24 h尿蛋白定量、尿素氮和血肌酐、外周血vWF含量均显着下降，Hb有所升高（均P<0.05）。见表1。
2.3 vWF免疫组化染色成果
vWF染色阳性呈黄色或黄棕色细颗粒样沉积在肾间质。正常对照组vWF染色均为阴性，少量血管染色为弱阳性，呈浅黄色。CAAN组vWF阳性表达显着添加，吸光值为（19.36±2.22）。EPO组vWF阳性表达较CAAN组削减，吸光值为（12.37±1.78）。见表2，封三图3。
3 评论
近20年来，含有马兜铃酸成分的中草药引起的肾脏危害遭到国内外的广泛重视。尽管近年来不断有相关试验研讨和临床研讨报告，但关于马兜铃酸肾病仍无老练医治计划，寻求有用的防备及医治办法是现在医学界重视的热门。有研讨报导马兜铃酸肾病在显着的肾间质纤维化之前，肾小管周围毛细血管（PTC）已有显着削减，且PTC削减的程度与肾间质纤维化程度呈正相关[7]。咱们课题组前期研讨[6，8]发现关木通致CAAN大鼠的肾间质微血管数目显着削减，微血管管壁玻璃样变、开裂，管腔阻塞。这些研讨均证明肾间质微血管病变是CAAN发作、开展重要机制。而血管内皮危害在肾脏微血管丢掉中起重要效果。促红细胞生成素是分子量34kDa的一种低分子糖蛋白，是重要的造血生成因子。近来研讨标明EPO并不局限于作为红细胞的调理因子，并且在抗凋亡、抗炎、抗氧化等方面发挥着积极效果[9]。在对急性大脑皮层缺血危害的研讨中发现，脑血管内皮细胞EPO受体表达添加，提示EPO可能具有维护内皮的效果，EPO可阻挠低氧诱导的脑血管内皮危害[10]。
根据以上机制，本研讨仿制CAAN动物模型给予EPO医治，医治组大鼠尿蛋白排泄量，尿素氮，血肌酐显着削减，提示EPO医治能够改进CAAN大鼠的肾功能。咱们发现CAAN大鼠血vWF水平显着升高，肾安排vWF的阳性表达添加；医治组大鼠血vWF水平下降，肾安排vWF的阳性表达削减。vWF主要由血管内皮细胞和巨核细胞组成，并储存在血管内皮细胞的Weibel-Palade小体中，在血管内皮细胞危害后可参加血栓的构成[11]，因而vWF常被作为检测内皮细胞危害程度的目标[12]。医治后vWF的显着下降，阐明EPO医治能够减轻CAAN大鼠的内皮细胞危害。一起研讨发现EPO医治组肾间质纤维化区域较CAAN组显着减小，咱们估测EPO医治能够削减肾脏微血管的内皮细胞危害进而削减肾脏微血管的丢掉，推迟肾间质纤维化的开展。
综上，EPO医治CAAN具有改进贫血以外的血管内皮维护效果，为EPO医治CAAN供给试验根据。
[参考文献]
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（收稿日期：2014-01-15）
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（收稿日期：2014-01-15）
