陈彦霞+++++刘津麟+++++李涯松
[摘要] 意图 构建真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Ascl2，并在真核细胞HEK293T细胞中表达，为往后研讨Ascl2基因在Tfh细胞的相关分子机制奠定试验根底。办法 PCR办法扩增健康人外周血单个核细胞中Ascl2基因，衔接至pIRES2-AcGFP1质粒的多克隆位点中，构建pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒。经过脂质体转染法对HEK293T细胞进行转染。Realtime-PCR及Westernblot办法剖析转染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒的HEK293T细胞中Ascl2表达状况。成果 经Realtime-PCR及Westernblot办法，证明Ascl2基因能够在HEK293T细胞中正确表达。定论 成功树立表达Ascl2基因的pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒，并能在HEK293T细胞中表达，为进一步研讨Ascl2在本身免疫性疾病中Tfh细胞的相关机制奠定了试验根底。
[要害词] Ascl2；HEK293T细胞；Tfh细胞；本身免疫性疾病
[中图分类号] R73-3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）21-0005-03
滤泡辅佐性T淋巴细胞（T follicular helper，Tfh）是近年研讨发现的CD4+T细胞的新亚群[1]。它的特征性标志为CXCR5+、PD-1+、ICOS+、CCR7-、Bcl-6+。Tfh细胞在机体的生发中心构成和B细胞分解中起重要效果，在对保持机体的免疫平衡发挥重要效果，它的功用失调与本身免疫性疾病及免疫缺点病中扮演重要人物[2-4]。新近研讨发现一种bHLH（basic Helix-Loop-Helix， 碱性螺旋-环-螺旋）转录因子：Ascl2（achaete-scute homologue 2）在Tfh细胞中选择性的表达上调[5]。体外试验中证明异位表达Ascl2能够上调T细胞中的CXCR5的表达，下调CCR7表达，而转录因子Bcl6则不受影响，体内试验则证明异位表达Ascl2可加快T细胞搬迁到滤泡及Tfh细胞的发育[5]。但是，Ascl2 在Tfh细胞在表达的详细功用及其调控Tfh细胞的详细分子机制还未彻底说明，本研讨旨在树立Ascl2 基因的真核表达载体，将其转染HEK293T细胞并使其表达，为研讨Ascl2对Tfh细胞的生物学功用供给试验依据。
1 资料与办法
1.1 质粒菌株和HEK293细胞
pIRES2-AcGFP1质粒购买于Clontech公司，大肠杆菌DH5α菌株购买于上海生工生物技术服务有限公司。HEK293T细胞购买于中国科学院上海细胞库。
1.2 首要试剂
限制性内切酶BglⅡ和SalⅠ，高保真pfu聚合酶以及T4衔接酶为美国Fermentas公司产品；质粒抽提试剂盒为上海生工生物技术服务有限公司产品；高糖DMEM培育基购买于Gibco公司；真核转染试剂 LipofectamineTM2000为Invitrogen公司产品；胎牛血清为杭州四季青生物工程资料有限公司产品；抗人Ascl2及β-actin抗体为Abcam公司产品；辣根过氧化物酶符号的IgG为美国CST公司产品；引物由上海生工生物技术服务有限公司组成。
1.3 HEK293T细胞的培育
HEK293T细胞惯例培育于含10%胎牛血清的DMEM高糖彻底培育基中，置于37℃，5%CO2孵育箱中贴壁培育，每隔2天用0.25%胰酶消化传代培育。
1.4 重组质粒pIRES2-AcGFP1-Ascl2的构建
1.4.1 Ascl2基因的扩增 取健康人外周血并用淋巴细胞别离液别离单个核细胞并抽提总RNA，在Pubmed上获取Ascl2 基因的CDS序列并规划引物，参加BglⅡ和SalⅠ 酶切位点，用高保真pfu聚合酶扩增Ascl2基因的CDS序列。
1.4.2 重组质粒构建 将PCR反响电泳收回产品和pIRES2-AcGFP1质粒别离由BglⅡ和SalⅠ 限制性内切酶37℃双酶切6 h，进行电泳凝胶收回，取5 μL酶切好的PCR片段及质粒DNA用T4衔接酶4℃衔接18 h，使Ascl2与pIRES2-AcGFP1质粒衔接，将衔接产品转化至DH5α感受态细胞在含50μg/mL Kana抗性的LB固体培育基上37℃培育箱中培育过夜，次日挑取单克隆菌落并参加LB液体培育基上摇菌16 h进行很多扩增，提取pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒。
1.5 pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒的转染
将5×105HEK293T细胞接种于6孔板中，于37℃、5%CO2培育箱中温育6 h后使细胞融合度到达70%时，别离用250 μL无血清DMEM高糖培育基液稀释4 μg的质粒或10 μL的 LipofectamineTM2000脂质体溶液，混匀并放置30 min后。将6孔板中培育液吸出，缓慢将混匀液参加6孔板中，于37℃、5%CO2培育箱中孵育6 h。6 h后弃去转染液，参加2 mL含10%胎牛血清的DMEM高糖彻底培育基持续培育，96 h后搜集细胞并提取总RNA及总蛋白。
1.6 检测转染pIRES2-AcGFP-Ascl2的HEK293T细胞中Ascl2的表达
1.6.1 Realtime-PCR检测Ascl2 mRNA表达的检测依据GenBank的人Ascl2 基因序列，规划荧光定量PCR引物并由上海生工生物技术服务有限公司组成。上游引物序列：5′AGCCAACCTGAAAACCCACA3′，下流引物序列：5′GAGTCTGAAGGTGCCGGAAA 3′， 规划并组成内参β-actin引物， 上游引物序列：5′GAATCAATGCAAGTTCGGTTCC 3′， 下流引物序列：5′ TCATCTCCGCTATTAGCTCCG 3′。在转染96 h后提取细胞总RNA并进行real-time PCR。反响条件为95℃10 min，95℃ 15 s及60℃ 55 s共40个循环，各组mRNA同内参β-actin基因比较得到相对表达量并进行计算。endprint
1.6.2 Western blotting检测Ascl2蛋白的表达 转染质粒96 h后的HEK293T细胞，吸去原培育液，PBS洗3次，用细胞裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白。95℃变性10 min。变性后样本在100 g/L聚丙烯酰胺凝胶上进行别离电泳（200 V，40 min），然后将别离后的蛋白转至硝化纤维膜（60 V，120 min）。将载有蛋白质的纤维膜用0.1% Triton-PBS溶液漂洗3次，10 min/次，并用脱脂奶粉关闭NC膜0.5 h，别离参加Ascl2和β-actin一抗4℃孵育16 h，再用1×TBST洗膜3次，10 min/次，充沛洗刷后参加辣根过氧化物酶符号的相应种属IgG二抗室温孵育0.5 h，再用1×TBST洗膜3次，10 min/次，终究漂洗后用ECL显色试剂盒进行显色，在显色后进行曝光。
1.7 计算学处理
选用曼-惠特尼U查验剖析HEK293T细胞和HEK293T-Ascl2细胞之间mRNA表达水平的差异，选用SPSS10.0计算软件包进行计算剖析，P<0.05为差异有计算学含义。
2 成果
2.1 Ascl2基因的提取与判定
PCR扩增外周血单个核细胞中Ascl2基因CDS序列后，PCR扩增产品经1.5%琼脂糖凝胶电泳别离检测，可见581bp的特异条带， 与pubmed上发布的Ascl2基因的CDS序列巨细共同（图1）。
图1 PCR办法扩增健康人外周血单个核细胞中Ascl2基因
（A：DNA分子量规范；B：PCR产品）
2.2 Ascl2基因真核表达载体的构建
将PCR扩增出的581bp的基因片段与空载体 pIRES2-AcGFP1衔接成功后，用BglⅡ和SalⅠ双酶切判定（图 2），并送测序，成果用 BLAST软件进行剖析，与 Pubmed中GenBank发布的序列共同。
图 2 重组质粒 pIRES2-AcGFP1-Ascl2的酶切判定
（A：DNA 分子量规范； B： pIRES2-AcGFP1-Ascl2/BglII+SalI）
2.3 转染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒的HEK293T细胞中Ascl2的mRNA及蛋白水平的检测
2.3.1 Real Time PCR检测Ascl2的mRNA成果 HEK293T-Ascl2细胞组Ascl2的mRNA表达量显着高于人HEK293T细胞组，差异有计算学含义（P=0.0235）（图3）。
图3 Real Time PCR检测转染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒96 h后各组Ascl2的mRNA表达水平
2.3.2 Western blotting检测Ascl2蛋白表达 在约28kDa（Ascl2）、42kDa（β-actin）处见到特异性条带，Ascl2-HEK293T组条带色彩比较HEK293T组色彩显着加深（图4），标明重组pIRES2-AcGFP1-Ascl2质粒能在HEK293T细胞中正确表达及翻译（图4）。
图4 Western blotting检测转染pIRES2-AcGFP-Ascl2重组质粒96 h后各组Ascl2蛋白的表达状况
3 评论
Tfh细胞是表达Ascl2的新式CD4+效应性T细胞亚群，其特征是能够搬迁并定坐落淋巴滤泡、发作IL-21等细胞因子、表达ICOS等共影响分子，然后终究辅佐B细胞发挥体液免疫的功用[6-9]。但关于Tfh细胞的研讨仍有许多重要问题有待进一步深入探讨，如Ascl2在机体发作本身免疫性疾病时，转录因子Ascl2是怎样参加Tfh细胞的发作开展的，是否能够经过有用按捺Tfh细胞的Ascl2 转录因子的表达来医治本身免疫性疾病等，跟着研讨的不断深入，Tfh细胞中的要害转录分子以及外表分子等将成为医治临床本身免疫性疾病的要害靶点[2，10]。
为此，在本研讨中咱们经过慢病毒pIRES2-AcGFP1络绎载体，将Ascl2和绿色荧光AcGFP1基因构建在一起，这将有利于对Tfh细胞中转录因子Ascl2进行定位和示踪。别的，经过pIRES2-AcGFP1络绎载体的内部核糖体进入位点序列（IRES），到达GFP基因和Ascl2 的别离表达，然后排除了AcGFP1荧光蛋白对Ascl2 蛋白功用的影响，然后为下一步研讨Ascl2分子在Tfh细胞介导的本身免疫性疾病中的效果及详细信号通路树立了试验根底，将有助于进一步说明本身免疫性疾病中Ascl2 分子经过何种机制促进Tfh细胞很多发作然后进一步辅佐B细胞发作很多的本身抗体，然后对临床系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎以及溃疡性结肠炎等本身免疫性疾病的发病机制进一步了解。
[参考文献]
[1] Ma CS，Deenick EK. Human T follicular helper （Tfh） cells and disease[J]. Immunol Cell Biol，2014，92（1）：64-71.
[2] Craft JE. Follicular helper T cells in immunity and systemic autoimmunity[J]. Nat Rev Rheumatol，2012，8（6）：337-347.
[3] Zhang X，Ing S，Fraser A，et al. Follicular helper T cells： new insights into mechanisms of autoimmune diseases[J]. Ochsner J，2013，13（1）：131-139.
[4] Liu X，Yan X，Zhong B，et al. Bcl6 expression specifies the T follicular helper cell program in vivo[J]. J Exp Med，2012，209（10）：1841-1852，S1841-1824.
[5] Liu X，Chen X，Zhong B，et al. Transcription factor achaete-scute homologue 2 initiates follicular T-helper-cell development[J]. Nature，2014，507（7493）：513-518.
[6] Yang X， Yang J， Chu Y， et al. T follicular helper cells mediate expansion of regulatory B cells via IL-21 in Lupus-prone MRL/lpr mice[J]. PLoS One， 2013，8（4）：e62855.
[7] King C，Tangye SG，Mackay CR. T follicular helper （TFH） cells in normal and dysregulated immune responses[J]. Annu Rev Immunol，2008，26：741-766.
[8] Shekhar S，Yang X. The darker side of follicular helper T cells： from autoimmunity to immunodeficiency[J]. Cell Mol Immunol，2012，9（5）：380-385.
[9] Xu H，Li X，Liu D，et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility[J]. Nature，2013，496（7446）：523-527.
[10] Liu X，Nurieva RI，Dong C. Transcriptional regulation of follicular T-helper（Tfh） cells[J]. Immunol Rev，2013， 252（1）：139-145.
（收稿日期：2014-04-22）endprint
1.6.2 Western blotting检测Ascl2蛋白的表达 转染质粒96 h后的HEK293T细胞，吸去原培育液，PBS洗3次，用细胞裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白。95℃变性10 min。变性后样本在100 g/L聚丙烯酰胺凝胶上进行别离电泳（200 V，40 min），然后将别离后的蛋白转至硝化纤维膜（60 V，120 min）。将载有蛋白质的纤维膜用0.1% Triton-PBS溶液漂洗3次，10 min/次，并用脱脂奶粉关闭NC膜0.5 h，别离参加Ascl2和β-actin一抗4℃孵育16 h，再用1×TBST洗膜3次，10 min/次，充沛洗刷后参加辣根过氧化物酶符号的相应种属IgG二抗室温孵育0.5 h，再用1×TBST洗膜3次，10 min/次，终究漂洗后用ECL显色试剂盒进行显色，在显色后进行曝光。
1.7 计算学处理
选用曼-惠特尼U查验剖析HEK293T细胞和HEK293T-Ascl2细胞之间mRNA表达水平的差异，选用SPSS10.0计算软件包进行计算剖析，P<0.05为差异有计算学含义。
2 成果
2.1 Ascl2基因的提取与判定
PCR扩增外周血单个核细胞中Ascl2基因CDS序列后，PCR扩增产品经1.5%琼脂糖凝胶电泳别离检测，可见581bp的特异条带， 与pubmed上发布的Ascl2基因的CDS序列巨细共同（图1）。
图1 PCR办法扩增健康人外周血单个核细胞中Ascl2基因
（A：DNA分子量规范；B：PCR产品）
2.2 Ascl2基因真核表达载体的构建
将PCR扩增出的581bp的基因片段与空载体 pIRES2-AcGFP1衔接成功后，用BglⅡ和SalⅠ双酶切判定（图 2），并送测序，成果用 BLAST软件进行剖析，与 Pubmed中GenBank发布的序列共同。
图 2 重组质粒 pIRES2-AcGFP1-Ascl2的酶切判定
（A：DNA 分子量规范； B： pIRES2-AcGFP1-Ascl2/BglII+SalI）
2.3 转染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒的HEK293T细胞中Ascl2的mRNA及蛋白水平的检测
2.3.1 Real Time PCR检测Ascl2的mRNA成果 HEK293T-Ascl2细胞组Ascl2的mRNA表达量显着高于人HEK293T细胞组，差异有计算学含义（P=0.0235）（图3）。
图3 Real Time PCR检测转染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒96 h后各组Ascl2的mRNA表达水平
2.3.2 Western blotting检测Ascl2蛋白表达 在约28kDa（Ascl2）、42kDa（β-actin）处见到特异性条带，Ascl2-HEK293T组条带色彩比较HEK293T组色彩显着加深（图4），标明重组pIRES2-AcGFP1-Ascl2质粒能在HEK293T细胞中正确表达及翻译（图4）。
图4 Western blotting检测转染pIRES2-AcGFP-Ascl2重组质粒96 h后各组Ascl2蛋白的表达状况
3 评论
Tfh细胞是表达Ascl2的新式CD4+效应性T细胞亚群，其特征是能够搬迁并定坐落淋巴滤泡、发作IL-21等细胞因子、表达ICOS等共影响分子，然后终究辅佐B细胞发挥体液免疫的功用[6-9]。但关于Tfh细胞的研讨仍有许多重要问题有待进一步深入探讨，如Ascl2在机体发作本身免疫性疾病时，转录因子Ascl2是怎样参加Tfh细胞的发作开展的，是否能够经过有用按捺Tfh细胞的Ascl2 转录因子的表达来医治本身免疫性疾病等，跟着研讨的不断深入，Tfh细胞中的要害转录分子以及外表分子等将成为医治临床本身免疫性疾病的要害靶点[2，10]。
为此，在本研讨中咱们经过慢病毒pIRES2-AcGFP1络绎载体，将Ascl2和绿色荧光AcGFP1基因构建在一起，这将有利于对Tfh细胞中转录因子Ascl2进行定位和示踪。别的，经过pIRES2-AcGFP1络绎载体的内部核糖体进入位点序列（IRES），到达GFP基因和Ascl2 的别离表达，然后排除了AcGFP1荧光蛋白对Ascl2 蛋白功用的影响，然后为下一步研讨Ascl2分子在Tfh细胞介导的本身免疫性疾病中的效果及详细信号通路树立了试验根底，将有助于进一步说明本身免疫性疾病中Ascl2 分子经过何种机制促进Tfh细胞很多发作然后进一步辅佐B细胞发作很多的本身抗体，然后对临床系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎以及溃疡性结肠炎等本身免疫性疾病的发病机制进一步了解。
[参考文献]
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[10] Liu X，Nurieva RI，Dong C. Transcriptional regulation of follicular T-helper（Tfh） cells[J]. Immunol Rev，2013， 252（1）：139-145.
（收稿日期：2014-04-22）endprint
1.6.2 Western blotting检测Ascl2蛋白的表达 转染质粒96 h后的HEK293T细胞，吸去原培育液，PBS洗3次，用细胞裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白。95℃变性10 min。变性后样本在100 g/L聚丙烯酰胺凝胶上进行别离电泳（200 V，40 min），然后将别离后的蛋白转至硝化纤维膜（60 V，120 min）。将载有蛋白质的纤维膜用0.1% Triton-PBS溶液漂洗3次，10 min/次，并用脱脂奶粉关闭NC膜0.5 h，别离参加Ascl2和β-actin一抗4℃孵育16 h，再用1×TBST洗膜3次，10 min/次，充沛洗刷后参加辣根过氧化物酶符号的相应种属IgG二抗室温孵育0.5 h，再用1×TBST洗膜3次，10 min/次，终究漂洗后用ECL显色试剂盒进行显色，在显色后进行曝光。
1.7 计算学处理
选用曼-惠特尼U查验剖析HEK293T细胞和HEK293T-Ascl2细胞之间mRNA表达水平的差异，选用SPSS10.0计算软件包进行计算剖析，P<0.05为差异有计算学含义。
2 成果
2.1 Ascl2基因的提取与判定
PCR扩增外周血单个核细胞中Ascl2基因CDS序列后，PCR扩增产品经1.5%琼脂糖凝胶电泳别离检测，可见581bp的特异条带， 与pubmed上发布的Ascl2基因的CDS序列巨细共同（图1）。
图1 PCR办法扩增健康人外周血单个核细胞中Ascl2基因
（A：DNA分子量规范；B：PCR产品）
2.2 Ascl2基因真核表达载体的构建
将PCR扩增出的581bp的基因片段与空载体 pIRES2-AcGFP1衔接成功后，用BglⅡ和SalⅠ双酶切判定（图 2），并送测序，成果用 BLAST软件进行剖析，与 Pubmed中GenBank发布的序列共同。
图 2 重组质粒 pIRES2-AcGFP1-Ascl2的酶切判定
（A：DNA 分子量规范； B： pIRES2-AcGFP1-Ascl2/BglII+SalI）
2.3 转染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒的HEK293T细胞中Ascl2的mRNA及蛋白水平的检测
2.3.1 Real Time PCR检测Ascl2的mRNA成果 HEK293T-Ascl2细胞组Ascl2的mRNA表达量显着高于人HEK293T细胞组，差异有计算学含义（P=0.0235）（图3）。
图3 Real Time PCR检测转染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒96 h后各组Ascl2的mRNA表达水平
2.3.2 Western blotting检测Ascl2蛋白表达 在约28kDa（Ascl2）、42kDa（β-actin）处见到特异性条带，Ascl2-HEK293T组条带色彩比较HEK293T组色彩显着加深（图4），标明重组pIRES2-AcGFP1-Ascl2质粒能在HEK293T细胞中正确表达及翻译（图4）。
图4 Western blotting检测转染pIRES2-AcGFP-Ascl2重组质粒96 h后各组Ascl2蛋白的表达状况
3 评论
Tfh细胞是表达Ascl2的新式CD4+效应性T细胞亚群，其特征是能够搬迁并定坐落淋巴滤泡、发作IL-21等细胞因子、表达ICOS等共影响分子，然后终究辅佐B细胞发挥体液免疫的功用[6-9]。但关于Tfh细胞的研讨仍有许多重要问题有待进一步深入探讨，如Ascl2在机体发作本身免疫性疾病时，转录因子Ascl2是怎样参加Tfh细胞的发作开展的，是否能够经过有用按捺Tfh细胞的Ascl2 转录因子的表达来医治本身免疫性疾病等，跟着研讨的不断深入，Tfh细胞中的要害转录分子以及外表分子等将成为医治临床本身免疫性疾病的要害靶点[2，10]。
为此，在本研讨中咱们经过慢病毒pIRES2-AcGFP1络绎载体，将Ascl2和绿色荧光AcGFP1基因构建在一起，这将有利于对Tfh细胞中转录因子Ascl2进行定位和示踪。别的，经过pIRES2-AcGFP1络绎载体的内部核糖体进入位点序列（IRES），到达GFP基因和Ascl2 的别离表达，然后排除了AcGFP1荧光蛋白对Ascl2 蛋白功用的影响，然后为下一步研讨Ascl2分子在Tfh细胞介导的本身免疫性疾病中的效果及详细信号通路树立了试验根底，将有助于进一步说明本身免疫性疾病中Ascl2 分子经过何种机制促进Tfh细胞很多发作然后进一步辅佐B细胞发作很多的本身抗体，然后对临床系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎以及溃疡性结肠炎等本身免疫性疾病的发病机制进一步了解。
[参考文献]
[1] Ma CS，Deenick EK. Human T follicular helper （Tfh） cells and disease[J]. Immunol Cell Biol，2014，92（1）：64-71.
[2] Craft JE. Follicular helper T cells in immunity and systemic autoimmunity[J]. Nat Rev Rheumatol，2012，8（6）：337-347.
[3] Zhang X，Ing S，Fraser A，et al. Follicular helper T cells： new insights into mechanisms of autoimmune diseases[J]. Ochsner J，2013，13（1）：131-139.
[4] Liu X，Yan X，Zhong B，et al. Bcl6 expression specifies the T follicular helper cell program in vivo[J]. J Exp Med，2012，209（10）：1841-1852，S1841-1824.
[5] Liu X，Chen X，Zhong B，et al. Transcription factor achaete-scute homologue 2 initiates follicular T-helper-cell development[J]. Nature，2014，507（7493）：513-518.
[6] Yang X， Yang J， Chu Y， et al. T follicular helper cells mediate expansion of regulatory B cells via IL-21 in Lupus-prone MRL/lpr mice[J]. PLoS One， 2013，8（4）：e62855.
[7] King C，Tangye SG，Mackay CR. T follicular helper （TFH） cells in normal and dysregulated immune responses[J]. Annu Rev Immunol，2008，26：741-766.
[8] Shekhar S，Yang X. The darker side of follicular helper T cells： from autoimmunity to immunodeficiency[J]. Cell Mol Immunol，2012，9（5）：380-385.
[9] Xu H，Li X，Liu D，et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility[J]. Nature，2013，496（7446）：523-527.
[10] Liu X，Nurieva RI，Dong C. Transcriptional regulation of follicular T-helper（Tfh） cells[J]. Immunol Rev，2013， 252（1）：139-145.
（收稿日期：2014-04-22）endprint
