大鼠脑缺血再灌注模型:吡格列酮对急性脑缺血再灌注损害大鼠TNF—α、IL—10和细胞凋亡的影响

来源:中国现代医生 ·2018年12月19日 10:40 浏览量:0

赵俞+余智+卢波达+刘凯的+方来明

[摘要] 意图 评论急性脑缺血再灌注危害大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-10(IL-10)和细胞凋亡的改动规则及吡格列酮(Pioglitazone,PGZ)干涉对上述目标的影响。 办法 将84只SD大鼠随机分为PGZ组(n=42)及对照组(n=42),前者经过改进Zea-longa法树立脑缺血再灌注危害模型后当即经尾静脉打针10 mg/kg的PGZ,对照组则用平等剂量的生理盐水替代PGZ,今后各组别离每24小时腹腔打针1次等量PGZ/生理盐水,直至SD大鼠被处死,并以伤后处死时刻分为7个亚组,别离为1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、3 d和7 d,每个亚组各6只。取缺血灶周围安排选用免疫安排化学办法检测并比较脑安排中TNF-α及IL-10的蛋白表达,一起选用TUNEL法调查并比较细胞凋亡状况。 成果 PGZ组TNF-α蛋白表达量较对照组显着下降(P<0.05),而IL-10显着上升(P<0.05),且两组中二者均呈显着负相关(P<0.01);一起PGZ组脑安排细胞凋亡数量较对照组也有所下降(P<0.05)。定论 脑缺血再灌注危害后,吡格列酮可能经过下降TNF-α的活性上调IL-10的表达,减轻炎症反响,阻挠神经细胞进一步凋亡,然后对缺血再灌注危害大鼠神经细胞发挥维护效果。

[关键词] 吡格列酮;脑缺血再灌注危害;TNF-α;IL-10;细胞凋亡

[中图分类号] R743.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2014)35-0001-04

现在在2型糖尿病的医治进程中,吡格列酮(Pioglitazone,PGZ)在削减外周安排和肝脏的胰岛素反抗、添加依靠胰岛素的葡萄糖处理、削减肝糖的输出方面具有重要含义。研讨标明,吡格列酮对脑缺氧缺血、低血糖、伤口和癫痫发作时发挥的神经维护效果与激活过氧化物酶增殖体激活受体-γ(PPARγ)按捺炎症等途径有关[1]。但是,其详细神经维护分子机制还有待进一步研讨。故本试验选用PGZ对改进Zea-longa 法树立大脑中动脉缺血再灌注危害模型大鼠进行医治干涉,检测TNF-α、IL-10蛋白的表达及其对细胞凋亡的影响,评论其对脑缺血再灌注危害大鼠神经维护分子机制,为该药用于脑缺血缺氧性疾病的临床防治供给试验根底和理论依据。

1 材料与办法

1.1 试验大鼠

选取84只清洁级雄性SD大鼠[浙江大学医学院动物试验中心供给,动物合格证号:SCXK(浙)2008-0033],体重(265±15)g。试验前大鼠禁食不由水12 h,用随机数字表法分为PGZ组42只、对照组42只,再依据伤后处死时刻分为7个亚组,别离为1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、3 d和7 d,每个亚组各6只。

1.2 首要试剂

吡格列酮(PGZ)(美国Sigma公司);肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白细胞介素-10(IL-10)免疫组化试剂盒(美国R&D Systems公司);TUNEL原位末端标记试剂盒(美国Promega公司);电子显微镜(日本OLYMPUS公司)等。

1.3 大鼠脑缺血再灌注危害模型的制备及处理

灌注。模型成功标志[2]:大鼠复苏后呈现术侧Horner综合征;爬行时跌倒或向右侧转圈;提尾悬拉后呈现缺血灶对侧上肢蜷缩委曲。PGZ组待大鼠天然复苏后当即经尾静脉打针PGZ 10 mg/kg,对照组则经尾静脉打针等量的生理盐水,今后各组别离每24小时经尾静脉打针一次等量PGZ/生理盐水,直至大鼠被处死。

1.4 调查目标

1.4.1 TNF-α及IL-10蛋白的表达 大鼠深度麻醉成功后,开胸露出并游离出心脏,以生理盐水灌洗到双肺色白,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚甲醛,敏捷断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24 h。在距额叶前端2.5 mm和8.5 mm处行冠状切片,取中心5 mm厚的脑安排块,沿矢状缝左边约1.5 mm处切除右侧部分,选取余下的左边脑块作为检测标本,即缺血半暗带脑安排。自前往后接连冠状位切片,厚约6 μm,每隔10张取两张切片,严厉按相关试剂盒供给的进程进行检测,在400倍显微镜下随机取5个不重复视界,调查并计数阳性细胞数,求其平均值并采图。

1.4.2 TUNEL染色 严厉依照TUNEL细胞凋亡试剂盒说明书进行操作。在400倍光镜下调查凋亡细胞(以胞核呈现棕黄染色颗粒代表),并核算计数阳性细胞数,求其平均值并采图。

1.5 统计学办法

使用SPSS 18.0统计学软件进行数据剖析。计量材料用(x±s)标明,两组在不一起刻点的目标比较别离选用两独立样本均数t查验与重复丈量材料方差剖析,组间要素为分组(PGZ组和对照组),组内要素为时刻点(7个不同处死时刻点),交互效果为分组×时刻;P<0.05为差异有统计学含义。

2 成果

2.1 TNF-α蛋白的表达

PGZ组大鼠缺血灶周围安排中TNF-α在术后1 h中开端表达,3 h呈现很多表达;6~24 h处于高度表达,再灌注危害后3 d呈强表达,至7 d表达量有所下降,并显着低于对照组(P<0.05);经过重复丈量材料的方差剖析成果显现,两组同一时刻点TNF-α蛋白表达比较,差异具有统计学含义(F组间=16.207,P=0.000<0.01);两组各不一起刻点TNF-α蛋白表达差异具有显着性(F组内1=13.999,P=0.000<0.01;F组内2=12.337,P=0.000<0.01);分组和时刻之间不存在交互效果(F交互=1.759,P=0.188>0.05),即PGZ组和对照组TNF-α蛋白的表达在各时刻点上的改动趋势是相同的,见表1、图1。

2.2 IL-10蛋白的表达

IL-10蛋白在危害灶周围安排细胞核中1 h时高表达,但3~12 h阳性细胞数逐步下降,24 h时阳性细胞数到达低峰,处于低表达状况,但7 d表达有所上升,并显着高于对照组(P<0.05);经过重复丈量材料的方差剖析成果显现,两组同一时刻点IL-10蛋白表达比较,差异具有统计学含义(F组间=9.819,P=0.002<0.01);二组各不一起刻点IL-10蛋白表达差异具有显着性(F组内1=105.707,P=0.000<0.01;F组内2=112.307,P=0.000<0.01);分组和时刻之间不存在交互效果(F交互=0.405,P=0.526>0.05),即PGZ组和对照组IL-10蛋白的表达在各时刻点上的改动趋势是相同的,见表1及图2。

2.3 神经细胞凋亡改动

PGZ组大鼠危害灶周围安排1 h开端呈现凋亡细胞,3~24 h凋亡细胞数逐步增多,3 d到达顶峰,但7 d凋亡细胞数较前有所削减,并显着低于对照组(P<0.05);选用重复丈量材料的方差剖析成果显现,两组同一时刻点凋亡细胞数比较,差异具有统计学含义(F组间=6.585,P=0.012<0.01);两组各不一起刻点凋亡细胞数比较差异具有显着性(F组内1=19.979,P=0.000<0.01;F组内2=21.136,P=0.000<0.01);分组和时刻之间不存在交互效果(F交互=0.540,P=0.465>0.05),即PGZ组和对照组凋亡细胞数在各时刻点上的改动趋势是相同的,见表1及图3。

2.4 TNF-α与IL-10蛋白的表达相关性剖析

两组脑安排TNF-α与IL-10蛋白的表达均呈显着负相关,以TNF-α蛋白的表达为自变量(independent variable),用X标明。IL-10蛋白的表达为应变量(dependent variable),用Y标明。回归方程Y1=0.43-0.261X,r2=-0.937(P<0.01),Y1=4.16-0.738X,r2=-0.951(P<0.01)。

3 评论

现在缺血性脑血管病已逐步成为导致人类逝世疾病中的首要要素[3],形成劳动力损失并花费巨额的医疗资源,对家庭和社会形成巨大的影响。因而,怎么进步急性缺血性脑血管病的效果是临床亟需处理的难题,而神经维护剂在缺血性脑血管疾病急性期的医治中具有重要效果,故寻觅有用的神经细胞维护剂是今世神经科学的重要课题之一。

脑缺血特别是缺血再灌注危害(ischemia reperfusion injury,IRI)的病理生理进程极为杂乱,其发病机制触及脑安排炎症反响、能量代谢紊乱、兴奋性氨基酸(EAA)的细胞毒性等多个学说。这些环节并不是孤立存在的,而是密不可分,互为因果,互相堆叠,终究导致神经细胞的凋亡或坏死[4]。很多研讨标明,脑缺血后炎症反响在缺血再灌注危害发病机制中具有重要位置[5]。咱们课题组前期的试验研讨也已证明,缺血再灌注后核转录因子的表达和炎性细胞滋润参加了脑缺血再灌注危害进程[6]。其间TNF-α由神经细胞、小胶质细胞和血管内皮细胞发作,是一种多效性促炎性细胞因子,其表达与细胞凋亡密切相关,跟着TNF-α表达的削弱,所触发炎性反响及神经细胞凋亡危害也逐步缓解[7]。此外,IL-10作为一种多功能负性调理因子,可削减巨噬细胞发作金属蛋白酶、自由基等有毒物质;减轻兴奋性神经毒性诱导的神经细胞危害;下调炎性细胞因子,阻挠炎症联级反响,对神经细胞具有必定程度的维护效果[8]。因而,在防治大鼠缺血再灌注脑危害中细胞凋亡中,咱们能够经过削减有害细胞因子的发作,添加有利细胞因子,然后到达削减缺血再灌注神经元凋亡所引起的继发性脑危害[9]。维护受损细胞,是现在医治缺血性脑血管疾病的一大靶点。

此外,细胞凋亡(Apoptosis)是细胞在体表里多种要素影响诱导下,由多种基因严厉调控而发作的有序改动的逝世进程。有文献报导[10,11],PPARγ激动剂吡格列酮能促进PPARγ mRNA和蛋白的表达,活化细胞外信号调理激酶而按捺炎症因子的表达,增强其对脑缺血再灌注危害后脑神经的维护效应,而且与剂量呈正比联系。本研讨发现经PGZ处理后的各时刻段大鼠脑安排TNF-α的表达较对照组显着下降,而IL-10的表达则相应增高,且两者的表达呈显着负相关,大鼠脑缺血半暗带中神经细胞凋亡数量显着减轻。由此咱们估测,PGZ可经过下调TNF-α的开释才能,上调抗炎介质(IL-10)的表达,发挥免疫抗炎效果,然后削减细胞凋亡。

由此可见,吡格列酮可负性调理脑缺血再灌注危害大鼠脑安排中TNF-α蛋白的表达,显着上调抗炎介质(IL-10)的开释,减轻了缺血后再灌注危害,然后较大程度地减轻细胞凋亡,为该药在脑缺血再灌注危害的医治中供给了宽广的使用远景。

[参考文献]

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(收稿日期:2014-09-25)

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(收稿日期:2014-09-25)

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