陈欢 刘燕玲 刘学睿
[摘要意图 评论大鼠前期酒精性肝危害模型的树立办法，为研讨前期酒精性肝危害的发病分子机制供给抱负动物模型。办法 24只雄性SD大鼠随机分为模型组（16只）和对照组（8只）。对照组饮用自来水；模型组饮用7%～56%梯度递加的白酒12周。选材前24 h和12 h，别离以56%白酒急性灌胃后处死大鼠。每天记载大鼠食用饲料量及饮用量；每周称量大鼠体重。选用全自动生化剖析仪测定大鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）含量。调查大鼠肝脏病理学和形状学改动。成果 12周后，模型组大鼠体重添加率为（61.67±1.98）% ，显着低于对照组的（160.09±3.12）% （P<0.05），肝脏指数模型组（3.74±0.54）高于对照组（2.85±1.26）（P <0.05）。模型组大鼠ALT、AST、TG、TC均较对照组增高（P<0.05），病理学查看模型组肝安排显着脂肪变性，伴部分炎症、坏死。定论 该模型操作简洁，动物逝世率低，安稳，发病进程与临床相似，是研讨前期酒精性肝危害发病分子机制的抱负模型。
[关键词]酒精性肝病；大鼠；肝病模型；肝功能
[中图分类号] R575 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）07（b）-0007-04
[Abstract]Objective To explore the method of establishing a model of early alcoholic liver disease（ALD） in rats in order to provide an ideal animal model for studying the molecular mechanism of early alcoholic liver injury.Methods Twenty-four male SD rats were randomly divided into experimental group （16 rats） and control group （8 rats）.In the control group，SD rats were fed with tap water.In the experimental group，SD rats were fed with alcohol of which the concentration of 7%-56% increased gradually for 12 weeks.During the experiment，the quantity of the fodder and the value of drinking were recorded everyday.Then the weight was weighed every week.24 and 12 hours before rats in experimental group were killed，they were treated with acute lavages with 56% alcohol.The activities of alanine aminotransferase （ALT），spartate aminotransferase （AST），riglyceride （TG） and total cholesterol （TC） in serum were determined by the fully automatic biochemical analyser.Moreover，the histological and morphological changes of liver tissues were observed. Results The growth rate of body mass was （160.09±3.12）% in the control group at the end of 12th week，while it was（61.67±1.98）% in the experimental group （P<0.05）.The ratio of liver body weight of the experimental group （3.74±0.54） was obviously increased compared with the control group （2.85±1.26）（P<0.05）.Compared with the control group，the levels of AST，ALT，TG and TC of the model group were clearly increased （P<0.05）.Meanwhile，the typical fatty liver pathologic changes，local inflammation and necrosis were observed in experimental group. Conclusion The results show that the ALD model with low mortality is stable and easy to copy，which is highly similar to the early ALD in human，and can be used in the study of ALD.
[Key words]Alcoholic liver disease；Rat；Liver disease model；Hepatic function
酒精濫用与依靠日益严峻已成为世界性公共卫生问题。长时刻很多喝酒易导致酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD），前期表现为脂肪肝，可发展为酒精性肝炎、肝纤维化及肝硬化；严峻酗酒可形成广泛肝细胞坏死乃至肝衰竭[1-3]。挑选与人类ALD相似的动物模型对研讨其发病机制具有重要含义。本试验树立酒精浓度梯度递加的白酒长时刻喂食基础上高浓度酒精急性灌胃诱导的大鼠肝危害模型，旨在为ALD树立有价值的研讨东西。
1材料与办法
1.1材料
SD雄性大鼠（清洁级）24只[西南医科大学动物试验中心供给，SCXK（川）2013-17]，均匀体重（200±15）g，养殖条件：温度20～25℃，相对湿度40%～70%。
1.2首要试剂
56度的北京红星二锅头白酒；HE染色剂：珠海贝索技能有限公司；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）试剂盒：南京建成生物有限公司。
1.3试验办法
1.3.1动物分组及处理
24只雄性SD大鼠随机分为试验组16只，对照组8只，均规范饲料喂食。对照组饮自来水，模型组饮浓度梯度递加的白酒12周，每周浓度：7%、14%、18%、22%、26%、30%、34%、45%、56%、56%、56%、56%。
1.3.2 调查记载大鼠精神状态、毛发色彩、饮食量、体重改动、逝世状况
1.3.3 肝安排标本收集与处理
12周末，处死大鼠前24 h和12 h，模型组大鼠给予56度的北京红星二锅头白酒（15 g/kg）灌胃2次，对照组等量生理盐水灌胃。禁食6 h后，20%乌拉坦（5 ml/kg）麻醉，剖开腹腔，调查肝脏巨细和外观。10%甲醛灌注固定30 min，别离肝脏，称取分量；肝门处切取约10 mm×10 mm的安排，10%甲醛固定。
1.3.4大鼠体重添加率及肝脏指数
称取大鼠体重，体重添加率（%）=（终分量-初始分量）/初始分量×100%。别离肝脏，称取肝脏湿重，肝脏指数=（肝脏湿重/大鼠体重）×100%。
1.3.5血清学目标检测
麻醉大鼠后右心房取血，静置30 min离心。按阐明书选用全自动生化剖析仪检测ALT、AST、TG和TC含量。
1.3.6肝脏病理改动及肝细胞形状学改动
肝安排固定后脱水、包埋。惯例办法制片，HE染色调查大鼠肝脏病理学改动，断定肝脂肪变程度（F0～F4）、炎症程度（G0～G4）和纤维化分级（S0～S4），依据酒精性肝病医治攻略[4]分级规范（如下）统计剖析。
1.3.6.1酒精性脂肪肝 依据肝细胞脂肪变性占所获取肝安排标本量的规模分为4度（F0～F4），肝细胞脂肪变F0：<5%：F1：≥5%～32%；F2：>32%～65%；F3：>65%～75%；F4>75%。
1.3.6.2酒精性肝炎 依据炎症程度分为4级（G0～G4）：G0无炎症；G1腺泡3带呈现少数气球样肝细胞，腺泡内散在单个点灶状坏死和中心静脈周围炎；G2腺泡3带显着气球样肝细胞，腺泡内点灶状坏死增多，呈现Mallory小体，门管区轻至中度炎症；G3腺泡3带广泛的气球样肝细胞，腺泡内点灶状坏死显着，呈现Mallory小体和凋亡小体，门管区中度炎症伴和（或）门管区周围炎症；G4交融性坏死和（或）桥接坏死。
1.3.6.3酒精性肝纤维化 依据纤维化的规模和形状分为4期（S0～S4）：S0无纤维化；S1腺泡3带局灶性或广泛的窦周/细胞周纤维化和中心静脉周围纤维化；S2纤维化扩展到门管区，中心静脉周围硬化性玻璃样坏死，局灶性或广泛的门管区星芒状纤维化；S3腺泡内广泛纤维化，局灶性或广泛的桥接纤维化；S4肝硬化。
1.4统计学办法
选用SPSS 14.0统计学软件进行数据剖析，计量材料用均数±规范差（x±s）标明，两组间比较选用t查验；等级材料比较选用秩和查验，以P<0.05为差异有统计学含义。
2成果
2.1一般状况
各组大鼠均无逝世。对照组大鼠生动，毛发光泽，食量正常。模型组胃口减退，毛色发黄，光泽度差，部分大鼠精神状态较差。模型组饮用液体量和食量均比对照组少。
2.2两组大鼠体重添加率及肝脏指数的比较
模型组与对照组体重均有上升，与对照组比较，模型组体重添加较慢，后期有下降趋势。12周后，对照组体重添加率显着高于模型组，差异有统计学含义（P<0.05）。模型组肝脏指数高于对照组，差异有统计学含义（P<0.05）（表1）。
2.3两组大鼠血清学目标的比较
模型组大鼠血清ALT、AST、TG、TC含量均高于对照组，差异均有统计学含义（P<0.05）（表2）。
2.4肝脏病理改动及肝细胞形状学改动
对照组肝脏棕赤色，外表润滑，边际锋利，质地柔软；模型组肝脏色泽较暗，黄褐色，外观肿大，边际圆钝。HE染色显现：对照组肝被膜完好，肝小叶结构完好，肝细胞摆放规整、严密，胞质丰厚，仅有少数脂滴，无显着变性、坏死及炎症细胞滋润（图1-A）。模型组肝小叶中心区劳累显着，中心静脉扩张，肝窦扩张，周围很多肝细胞水样变性，脂肪变性显着；有小灶性肝细胞坏死，未见片状坏死；可见炎细胞滋润，纤维病变不显着（图1-B）。按分级规范计分后统计剖析可见，模型组动物肝细胞脂肪变性和炎性病变程度与对照组比较，差异有统计学含义（P<0.05）；两组肝细胞纤维性变程度比较，差异无统计学含义（P>0.05）（表3～5）。
3评论
酒精乱用与依靠现象日渐严峻，ALD发病率呈逐年上升趋势。10%～20%的长时刻很多喝酒者可发作程度不等的ALD，危害身体健康[5]。ALD模型树立与动物种属、造模办法、条件、时刻及试验意图等多要素密切相关[6]。树立可重复、简单易行、安稳，且与临床相似的动物模型对ALD的研讨至关重要。
急性酒精灌胃、缓慢酒精喂食、胃内喂食等是国内常用的ALD造模办法，其间急性酒精灌胃法较常用[7-10]，但各试验室在酒精浓度、剂量、灌胃次数等方面无统一规范，且直接灌胃动物逝世率高，模型不安稳。本试验参照Maricic等[11-12]的办法进行了改进，树立了以酒精浓度梯度递加白酒长时刻喂食基础上高浓度酒精急性灌胃诱导的大鼠ALD模型。该办法与临床酒精性肝危害患者发病进程相似，有杰出模仿性，简单易行。
经过对大鼠一般状况、体重添加率、肝脏指数等目标的观测，试验组与对照组差异有统计学含义。肝脏是酒精代谢的首要场所，长时刻过量喝酒可导致肝细胞变性，膜通透性增强，细胞内容物释放入血，血清酶学改动。ALT、AST是反映肝细胞危害最灵敏的目标[13-14]，其间ALT确诊价值最高[15]，仅1%的肝细胞坏死即可致血清ALT水平升高1倍。当AST值超越ALT时，提示肝本质危害严峻，为缓慢加剧标志之一[16]。本试验模型组血清ALT、AST均显着高于对照组，阐明该造模方法可有用損伤动物肝脏细胞，损坏肝功能。研讨发现，酒精可经过发生自由基及脂质过氧化效果形成肝细胞化学性危害[17-18]。酒精进入机体后，在乙醇脱氢酶和微粒体乙醇氧化酶效果下脱氢氧化为乙酸，使肝细胞内还原型辅酶Ⅰ/辅酶Ⅰ（NADH/NAD）比值升高，按捺三羧酸循环，氧化脂肪酸才能下降，TG组成添加，肝细胞脂肪堆积导致细胞脂肪变性[19]。肝脏中积蓄的TG以极低密度脂蛋白（VLDL）方法出肝入血，血清TG含量相应添加，是反映肝危害的目标之一[20]。本研讨发现，试验动物血清模型组TG、TC均显着高于对照组，证明该模型成功仿制ALD特征。
长时刻酒精缓慢影响基础上急性危害后，模型组大鼠肝脏形状学和病理学检测均见显着反常。依据2010年中华医学会肝病学分会发布的《酒精性肝病医治攻略（2010年修订版）》的安排病理学确诊规范，分级后统计学剖析标明模型组动物肝细胞呈现显着脂肪变性和炎性病变，与对照组比较，两项目标差异均有统计学含义（P<0.05）。而两组肝细胞纤维性变程度比较，差异无统计学含义（P>0.05），可能与该种造模方法酒精影响较平缓，时刻较短有关。
综上所述，本试验成功取得与人类喝酒习气及临床发病特征相似的ALD前期动物模型。该模型安稳，操作简洁且动物逝世率低，为后续试验靶向前期酒精性肝病的分子机制研讨和临床防治供给较好模型。
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（收稿日期：2017-04-12 本文修改：任 念）
