刘星+张良胜+诸波+査克岚+张雪梅+杨悠+范忠才
[摘要] 意图 评论糖尿病心肌病（DCM）大鼠心室肌细胞瞬时外向钾电流（Ito）的改动，了解其在电重构中的效果。办法 选用20只健康成年SD大鼠，随机分为对照组（n=10）和DCM组（n=10），并经过病理安排学证明为DCM心肌病理学改动。别离对两组大鼠选用改善的耐钙成年大鼠急性酶别离办法别离心肌细胞，运用膜片钳技能以全细胞形式别离记载两组大鼠心室肌单细胞的Ito和膜电容，并剖析比较两组大鼠心室肌Ito的改动。 成果 与对照组比较，DCM组大鼠左心室心肌细胞的Ito电流密度显着低于对照组[+70 mV时，（16.80±9.10） pA/pF vs （36.25±5.20） pA/pF]（P<0.05），DCM组的Ito的I-V曲线显着较对照组下移。 定论 DCM的Ito数量显着削减，在DCM心肌电重构中起着重要效果。Ito的削减及Ito通道的散布密度不同，可导致动作电位时程与有用不应期发作改动，可能与临床严峻心律失常的发作有关。
[关键词] 糖尿病心肌病；电重构；膜片钳；瞬时外向钾电流
[中图分类号] R587.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）09（a）-0004-05
Effect of transient outward potassium current on ventricular electrophysiological remodeling in diabetic cardiomyopathy
LIU Xing1 ZHANG Liang-sheng2 ZHU Bo1 ZHA Ke-lan1 ZHANG Xue-mei1 YANG You1 FAN Zhon-cai1▲
1.Department of Cardiology，the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College，Luzhou 646000，China；2.Department of Cardiology，People′s Hospital of Yongcheng City in Henan Province，Yongcheng 476600，China
[Abstract] Objective To investigate the changes of the transient outward potassium current （Ito） on ventricular myocardium in diabetic cardiomyopathy （DCM） rat and to explore the meaning of theses changes for ventricular electrophysiological remodeling. Methods 20 healthy adult Spprague-dawley rats were selected and randomly divided into control group （n=10） and DCM group （n=10）.The myocardial pathological alterations of DCM were identified in DCM group by histopathologic test，and cardiomyocytes in both groups were separated by advanced calcium-tolerant separation method.Whole-cell path clamp technique was used to record the unicellular changes of Ito and membrane capacitance in left ventricular myocytes for DCM and control group respectively.All data were analysed and compaired by software. Results Compared with control group，the Ito density on left ventricular myocytes was significantly lower in DCM group than that of the control group [（16.80±9.10） pA/pF vs （36.25±5.20） pA/pF，at +70 mV]（P<0.05），and the I-V curve of Ito in DCM group was more depressed than the control group markedly. Conclusion The changes of Ito play an important role in cardiac electrophysiological remodeling of diabetic cardiomyopathy.The reduction of Ito and the variations of Ito density may be lead to the modifications of action potential duration and effective refractory period，which associates with severe arrthymia.
[Key words] Diabetic cardiomyopathy；Electrophysiological remodeling；Pacth clamp；Transient outward potassium current
糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是指由糖尿病引起的心脏微血管病变、心肌代谢紊乱和心肌纤维化，终究引起心室肥厚、舒张期和（或）缩短期功用障碍的一种疾病状况[1]。DCM是一种特异性心肌病，发病率高且其潜在患者数量巨大，极易导致心力衰竭和严峻心律失常。临床研讨发现，DCM严峻心律失常的发作率十分高，其一旦发作不只恶化心功用，加剧心肌损害，并且极易导致患者逝世。现在大都学者以为DCM恶性心律失常的发作与心室肌离子流及其通道改动即电重构现象有关。瞬时外向钾电流（Ito）是心肌细胞上发现较早的离子流，关于心肌细胞1期复极及渠道期构成有重要影响；一起Ito在心内、外膜心肌上的正常散布密度可坚持其正常的动作电位时程（active potential duration，APD）离散度，然后起到坚持心肌电安稳的效果。一旦Ito发作结构和功用以及散布的紊乱极易导致心肌的电学改动，临床上可体现为心律失常。本研讨经过链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）腹腔打针树立大鼠DCM模型，运用膜片钳技能检测心室肌细胞Ito的改动，以明晰Ito电流在DCM心室电重构中的改动状况，然后了解其在电重构中的效果，有助于说明DCM心室电重构的发作机制及其与心律失常的联系。
1 材料与办法
1.1 试验动物
健康SD成年大鼠20只，清洁级，男女不拘，体重180～220 g，购于第三军医大学医学试验动物中心。试验中对动物处置契合动物伦理学规范。
1.2 试剂与首要仪器
1.2.1 首要试剂 胶原酶Ⅱ，血清白蛋白，牛磺酸，乙二醇双四乙酸（EGTA），羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），谷氨酸，氯化钴，STZ，天冬氨酸钾。均为Sigma公司产品。
1.2.2 首要仪器 膜片钳放大器（CEZ-2300，Nihon konden，Japan）；A/D转换器（Digidata 1322A，Axon Instruments，USA）；倒置相差显微镜（Axivert-135，Zeiss，Germany）；三维操纵器（WN 203，Narishige，Japan）；电极经横式拉制机（P-97 sutter，USA）；体视显微镜（S8APO，LEICA，Germany）；Langendorff灌流设备（ML176，Austrilia）等。
1.3 试验办法
1.3.1 DCM大鼠造模 将20只SD大鼠随机分为对照组（n=10）和DCM组（n=10），对照组一直以一般饲料喂食，DCM组以高脂饮食喂食（20%蔗糖、10%猪油、10%蛋黄粉，0.5%胆固醇和59.5%根底饲料）。喂食至第6周DCM组以1%STZ 30 mg/kg腹腔打针，对照组以同体积枸橼酸缓冲液一次性腹腔打针。72 h后尾静脉取血测空腹血糖，血糖≥11.1 mmol/L判别为2型糖尿病造模完毕。对照组一般饲料喂食6周，DCM组高脂高糖饲料喂食6周[1-2]。
1.3.2 别离心肌细胞 将无钙台氏液、KB液和酶液别离用95%O2和5%CO2饱满30 min，翻开与Langendorff相连的恒温浴槽相连，检测温度为37℃。用去离子水冲刷Langendorff体系10 min。用3%戊巴比妥钠0.2 ml/100 g，肝素4 U/g对SD大鼠腹腔打针。麻醉成功后，剪开大鼠胸腔，敏捷取出心脏后置于4℃无钙台氏液中，悄悄揉捏心脏排出残血，经主动脉逆行插管，固定于Langendorff灌流设备上。先用无钙台氏液冲净残存在冠状动脉和心室中的血液，换成消化酶液以8 ml/min继续灌流6～7 min，然后每隔1 min剪取一小块左心室安排，共10次，顺次装于盛有KB液的10个小瓶中。将取下的心肌安排块剪碎，用吸管悄悄吹打，再用200目筛网过滤，得到细胞混悬液，置于氧饱满的KB液保存，室温下1 h后置于4℃冰箱中备用[3]。
1.3.3 全细胞膜片钳记载Ito 取急性酶别离的大鼠心肌细胞，选用全细胞膜片钳记载形式记载电流。挑选细胞膜润滑完好、横纹清楚、无缩短的细胞，制造构成细胞贴附式膜片（cell-attached patch），在此根底上，向微电极内给予较强的负压构满足细胞记载构型。终究施以Ito电流影响计划，引导出Ito电流影响波形。本试验运用膜片钳放大器（CEZ-2300，Nihon konden，Japan）记载电流信号，经A/D转换器（Digidata 1322A，Axon Instruments，USA）处理后，用Clampex（version 10.1）软件体系收集后贮存于计算机中。采样频率为10 kHz，采样办法为Clampex下的Episodic stimulation[4-5]。
1.4 统计学处理
选用Originpro 8.0对数据进行统计剖析，计量材料以均数±规范差（x±s）标明，选用t查验，以P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 心肌细胞的细胞活性
镜下可见两种细胞：一种为逝世细胞，细胞挛缩，呈圆形或许椭圆形，横纹消失，细胞溶解，细胞膜决裂；另一种细胞为存活心肌，呈杆状或矩形，横纹明晰，外表洁净，折光性好，立体感强（图1箭头）。
图1 别离的心室肌细胞（箭头所指）
2.2 病理切片调查成果
随机抽取对照组及DCM组各两只大鼠作病理切片检查，成果对照组心肌纤维摆放规整，可见横纹，胞质丰厚，细胞空隙正常（图2）。DCM组心肌细胞呈空泡状，摆放紊乱、歪曲，部分心肌纤维开裂、坏死，坏死心肌由纤维安排代替，契合DCM心肌病理改动（图3）。
图2 对照组左室心肌细胞HE染色（×400）
图3 DCM组左室心肌细胞HE染色（×400）
2.3 心室肌细胞Ito的改动
坚持电坐落-80 mV下，以10 mV为阶跃，自-50 mV除极至+70 mV，胁迫时刻为300 ms引出Ito（图4～图6）。经过记载将Ito的电流强度、膜电容、电流密度进行剖析。
图4 DCM组左心室肌细胞Ito
图5 对照组左心室肌细胞Ito
图6 Ito的影响计划
2.3.1 膜电容 DCM组心室肌膜电容为（59.92±15.96） pF，对照组的膜电容为（58.75±16.41） pF，两组差异无统计学含义（P>0.05）（图7）。
图7 DCM组与对照组左心室肌细胞膜电容
2.3.2 电流密度 -40～-20 mV，DCM组Ito密度略高于对照组（P>0.05）；在胁迫电位-10～+70 mV，DCM组Ito密度低于对照组（P<0.05），且随胁迫电位添加差异性越显着，当指令电压到达+70 mV时，DCM组电流密度为（16.80±9.10） pA/pF，而对照组达（36.25±5.20） pA/pF，差异有统计学含义（P<0.05）（表1）。
表1 DCM组与对照组大鼠心肌细胞Ito的电流密度（pA/pF，x±s）
与对照组比较，*P<0.05
2.3.3 I-V曲线 DCM组和对照组的I-V曲线均呈线性依赖性，为内向整流特性，指令电压-50～-20 mV，电流起伏添加不显着，两组曲线走向陡峭。指令电压 -20～+70 mV，对照组电流增幅较大，而DCM组增幅较小，DCM组显着较对照组下移，尤其是在指令电压 +10 mV今后更为显着（图8）。
图8 对照组与DCM组心室肌细胞Ito的I-V曲线
3 评论
1974年Hamby等初次提出DCM的概念，指由糖尿病引起心脏微血管病变、肌代谢紊乱和心肌纤维化等所造成的的心肌广泛结构反常，终究引起左心室肥厚、舒张期和（或）缩短期功用障碍的一种疾病状况[6]。糖尿病及其并发的DCM简单导致心力衰竭和多种心律失常。很多研讨显现，糖尿病是心房颤动的独立高危因子[7-8]；糖尿病患者极易发作室性心律失常及猝死[9-10]，严峻威胁着人类的生命健康。但是现在对这类受损心肌发作心律失常的机制尚不甚清楚。以往很多的研讨现已证明心律失常的发作与细胞表里离子流以及相关离子通道的改动即电重构密切相关。因而，明晰DCM心肌细胞是否存在电重构，以及相关的离子及通道发作了怎样的改动含义严峻，有助于说明DCM发作心律失常的电生理机制。
在心肌细胞，钾离子（K+）直接参加心肌电振奋的康复进程，对APD的长短具有决定性效果，故K+浓度及K+通道的改动是导致严峻心律失常的重要要素之一。细胞内K+浓度的改动首要依赖于细胞内的K+外流，其间Ito在APD 0相时被激活并参加了APD 1相复极进程。Ito是心肌细胞上发现较早的离子流，包括两种成分：Ito1与Ito2。它们的发作机制不同，Ito1是对4-APD灵敏的（SH族），后者是Ca2+依赖性的（SLO族），但在分子结构上均由4个α螺旋亚单位构成。Ito2状况复杂，研讨较少，一般Ito均指Ito1。Ito1对2相APD的开始水平起决定性效果，调理L-Ca2+通道及Na+-Ca2+交流的活性，影响APD[11]。在大鼠和人类心肌细胞上Ito电流很强，电生理特性类似[12]。在大鼠和人类心室肌记载到动作电位1期的切迹是由Ito引起的，Ito关于1期复极及渠道期构成有重要影响。若Ito很强，APD呈三角形，APD缩短；反之Ito削弱，渠道期延伸，APD延伸。有报导以为Ito削弱，使心室复极延伸，可引发各种心律失常[13]。Ito不同的散布密度份额会使心外膜与心内膜APD不同，然后使心脏APD离散度添加，引起各向异质性，导致折返性心律失常。Ito相关的钾通道首要有KV1.4、KV4.2和KV4.3，在不同的哺乳动物，三种通道散布不同[14]。在人类KV4.3对Ito构成起首要效果[15]，KV1.4有少数表达。有研讨标明，心力衰竭时KV4.3在心肌的表达量显着下降，而KV1.4表达则上升，并在不同的部位上升的起伏不同，这可能对心室肌Ito散布密度梯度的构成有首要效果[16]。因而，研讨Ito在电重构中的效果有重要含义。
本课题经过对两组大鼠心肌细胞Ito的记载及剖析显现，在电压为+70 mV时，DCM组的电流密度较对照组显着下降（P<0.05），从I-V曲线看，DCM组较对照组下移显着。该成果证明了在DCM心室肌细胞存在Ito的显着改动，这可能是导致其心室电重构的重要离子改动，发作这种成果的原因可能是：①DCM心室肌细胞Ito敞开数目削减或通道敞开受按捺；②DCM心肌细胞广泛水肿，导致细胞膜电容增大，Ito电流相对减小。依据本试验成果及其他学者相关研讨，以为在DCM的电重构可能体现如下：①在DCM发病进程中，心室肌细胞Ito减小，引起1相复极速度减慢，渠道期延伸，有用不应期和APD延伸，整个复极时刻延伸，发作后除极，发作心律失常；②Ito不同的散布密度份额，心内膜与心外膜APD不同，动作电位离散度添加，引起各向异质性，构成折返，在临床上体现为各种心律失常，如室性心动过速、心室颤动等。
综上所述，DCM心肌细胞存在电重构，Ito在其间扮演着重要人物，进一步充沛深入研讨该离子通道的改动及相关影响要素，将有助于说明DCM电重构的发作开展机制及其与心律失常的联系，然后为不久的将来临床防治DCM心律失常供给新的办法奠定理论根底。
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（收稿日期：2014-07-15 本文修改：郭静娟）
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（收稿日期：2014-07-15 本文修改：郭静娟）
