洪琼川 唐绮玲 跨进
[摘要]意图 清晰TNF-α引起人肺鳞癌细胞发作EMT改动并促进肿瘤细胞侵袭、搬运的潜在相关机制。办法 选用TNF-α处理后的人肺鳞癌SK-MES-1细胞，经过划痕-愈合试验、Transwell试验办法检测肿瘤细胞运动、搬迁及侵袭才能，选用Western blot办法检测细胞是否发作EMT（标志物Vimentin和E-cadherin）改动。成果 TNF-α能促进人肺鳞癌SK-MES-1细胞的运动、搬迁、侵袭才能，且能使细胞发作EMT改动，上皮标志物E-cadherin下降，间充质标志物Vimentin表达升高。定论 TNF-α能够诱导人肺鳞癌SK-MES-1细胞发作EMT改动然后具有更强的搬运才能。
[关键词]肺鳞癌；TNF-α；EMT；搬运
[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）06（a）-0013-04
[Abstract]Objective To clarify the potential mechanism of TNF-α inducing human squamous cell carcinoma of lung to produce EMT changing and promoting the invasion and metastasis of carcinoma cells.Methods SK-MES-1 cells of Human lung squamous cell carcinoma treated with TNF-α，and the motion，migration and invasion ability of lung cancer cells were detected by Scratch-wound assay and Transwell chamber assay，and Western blot was performed to examine whether the cell producing EMT change or not （markers Vimentin and E-cadherin）.Results TNF-α could promote the motion，migration and invasion ability of SK-MES-1 cells of Human lung squamous cell carcinoma，and could make the cell produce EMT change，the epithelial marker （E-cadherin） decreased and the expression of the mesenchymal marker （Vimentin） increased.Conclusion TNF-α can induce EMT change in squamous cell carcinoma of lung and promote metastasis.
[Key words]Squamous cell carcinoma of lung；TNF-α；EMT；Metastasis
肺癌是全球范圍内较为常见的恶性肿瘤类型，在我国其发作率及死亡率均位居恶性肿瘤首位。肺癌中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）占80%以上，包含腺癌、鳞癌和大细胞癌等[1]。尽管现代医疗技能飞速开展，可是大多数患者在确诊时已为中晚期，失掉手术切除治好的时机[2]，且术后患者复发及远处搬运率高[3]，导致肺癌的医治效果差，5年生存率较低[4]。
上皮细胞间充质转化（EMT）的发作在肿瘤搬运中发挥重要效果，TNF-α能促进多种肿瘤的侵袭和搬运[5-6]，其机制可能与EMT的发作有关，本试验研讨意在评论TNF-α对人肺鳞癌SK-MES-1细胞发作EMT及侵袭搬运才能的影响，并了解其内涵可能的机制。
1 材料与办法
1.1 细胞的培育
人肺鳞癌SK-MES-1细胞株在37℃条件下在浓度为5%的 CO2培育箱中放入含有胎牛血清的培育基中，进行传代培育，每周2～3次。以人肺鳞癌SK-MES-1细胞为试验材料，TNF-α（10 ng/ml）处理组为试验组，TNF-α（-）未处理组为对照组。
1.2 细胞划痕-愈合试验调查TNF-α（10 ng/ml）对人肺鳞癌SK-MES-1细胞的运动才能的影响
①试验组：TNF-α（10 ng/ml）处理组；对照组：TNF-α（-）未处理组。
②惯例细胞培育，取对数生长期的细胞，接种于平板中，别离在两组细胞的平板中运用枪头尖（2.5 μl）悄悄划出痕迹，然后选用符号笔将划痕处进行符号。待运用PBS缓冲液将细胞进行冲刷后，继续进行培育，时刻为24 h，运用倒置相差显微镜对划痕处的间细胞距离进行调查，并对细胞的运动才能进行判别。
1.3 Transwell试验检测TNF-α（10 ng/ml）干预后对人肺鳞癌SK-MES-1细胞迁徙及侵袭才能的影响
1.3.1试验组 TNF-α（10 ng/ml）处理组；对照组：TNF-α（-）未处理组。
1.3.2搬迁试验 ①取对数生长期细胞，制备无血清细胞悬液，并计数为2×105/ml。每组均别离参加100 μl细胞悬液于上室，并鄙人室中参加500 μl浓度为10%的FBS开端培育，培育条件为37℃浓度为5%的CO2培育箱，时刻为24 h。②将下室中的培育基吸去，然后选用棉签对上室的内胶，选用PBS缓冲液进行清洗，并运用浓度为4%的多聚甲醇将其进行固定处理，结晶紫染色，倒置显微镜下（×100），每张膜取上、下、左、右、中 5 个视界计数接连5次进行摄影，求取平均值。
1.3.3侵袭试验 ①取无血清培育基，总量为200 μl，向其间参加50 μl Matrigel胶仿照基底膜，构建侵袭性检测体系，混匀，4℃操作，向上室各参加60 μl；放入37℃培育箱中，培育时刻为4～5 h。②同搬迁试验过程。
1.4 EMT相关标志物（E-cadherin，Vimentin）的检测
为了清晰TNF-α（10 ng/ml）对人肺鳞癌SK-MES-1细胞的标志物E-cadherin、Vimentin的影响，选用Western blot检测TNF-α（10 ng/ml）处理人肺鳞癌SK-MES-1细胞不同时刻（0、1、3、5 h）时E-cadherin，Vimentin的表达状况。
1.4.1试验组 TNF-α（10 ng/ml）处理组；对照组：TNF-α（-）未处理组。
1.4.2细胞总蛋白的提取 ①将培育瓶中陈腐的培育基弃除后选用PBS缓冲液对细胞洗刷3次，并选用挂勺将细胞悄悄刮掉；②向其间参加PBS缓冲液吹打，剂量为1 ml，然后将细胞搬运至1.5 ml预冷的Ep管中，离心分离，转速为12 000 r/min，时刻为2 min；③将上清液撇去后选用细胞裂解液处理，混合均匀后放置于冰中，时刻为30 min，而且需求每距离4 min进行混合操作；④4℃ 12 000 r/min离心5 min；⑤取上清液并将其置于全新的Ep管中，而且在-80℃的恒温冰箱中保存。
1.4.3 BCA法蛋白定量 ①首要需求依据样品的数量，向其间参加适量的工作液，而且將其混合均匀；②在彻底溶解蛋白规范品中参加10 ml浓度为0.9%的氯化钠溶液并将其依照100∶1份额进行稀释，终浓度需求调整为0.5 mg/ml；③将规范品顺次介入培育办中，而且需求向其间参加稀释液；④在96孔培育办中增加规范品，而且需求将其进行稀释处理，然后向其间参加BCA工作液，在37℃的条件下放置30 min；⑤在波长570 nm的条件下对各个小孔的OD值进行测定，制作规范曲线后对各组的蛋白浓度进行精确检测。
1.4.4 Westen blot检测各蛋白表达 选用Westen blot的规范检测办法测定两组细胞中E-cadherin、Vimentin的表达状况。（抗体：美国Cell signal公司的Vinment抗体，美国Santan Cruz公司的E-cadherin抗体，及相关的二抗IG/FITC，二抗IG/TRITC ），运用Image J软件对各种蛋白的相对含量进行定量剖析。
1.5 统计学剖析
运用SPSS 15.0软件，计量材料以均数±规范差（x±s）标明，两样本和多样本比较别离选用t查验和方差剖析，以P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 人肺鳞癌SK-MES-1细胞划痕试验
TNF-α效果细胞24 h后，TNF-α处理组中，细胞的搬迁速度比对照组显着加速（图1）。
2.2 Transwell试验
搬迁试验中，处理组和对照组细胞数别离是（257±29）、（118±14）个，组间差异有统计学含义（P<0.05）；侵袭试验中，TNF-α处理后两组的细胞数别离为（98±5）、（61±6）个，组间差异有统计学含义（P<0.05）（图2）。
2.3 Western blot检测EMT相关蛋白
Western blot检测发现TNF-α（10 ng/ml）处理组中，上皮标志物E-cadherin下降，间充质标志物Vimentin表达升高，标明TNF-α诱导人肺鳞癌SK-MES-1细胞发作EMT改动（图3）。
3 评论
肺鳞癌是最常见的恶性肿瘤之一， 在疾病晚期发作肿瘤细胞血管及淋巴结搬运的危险较高而且危险性也较为严峻[7]，在该病开展及搬运过程中存在有多种基因和多种物质因子的改动[8-9]。TNF-α是一种单核因子，分子质量为26kD的跨膜小分子蛋白，主要由单核细胞和巨噬细胞发作，归于炎症调理因子之一，是肿瘤微环境中重要的组成部分，多项研讨标明TNF-α在炎症、免疫、细胞稳态及肿瘤增殖，血管构成，侵袭和搬运等开展过程中发挥重要效果[10-11]。
EMT即上皮细胞间充质转化，上皮细胞是高度有序均一的单层细胞，其主要特色为彼此之间严密附着，当上皮细胞转化为间充质细胞时，则形态万千，表现出更多的搬迁和侵袭才能[12]。EMT作为肺鳞癌搬运过程中的重要阶段，尤其是在发作搬运现象的运动细胞的前缘的呈现频率最高[13-14]，而且上皮细胞标志物丢掉，故此间质细胞标志物水平升高，是恶性肿瘤患者发作远处搬运的过程中向血管侵袭的底子条件[15-16]。
本研讨中调查TNF-α对人肺鳞癌SK-MES-1细胞搬迁及侵袭才能的影响，以期对其相关机制进行进一步了解。首要，经过细胞划痕-愈合试验调查到经TNF-α效果后的人肺鳞癌SK-MES-1细胞的运动速度比对照组（未用TNF-α处理组）显着加速；其次，经过Transwell的搬迁和侵袭试验发现，TNF-α效果细胞组的搬迁和侵袭才能较对照组显着增强（P<0.05）；最终，检测试验组细胞EMT相关蛋白的表达量，经TNF-α效果后细胞发作EMT改动，上皮标志物E-cadherin下降，间充质标志物Vimentin表达升高，提示TNF-α可能经过诱导人肺鳞癌SK-MES-1细胞发作EMT改动而增强肿瘤细胞的运动、搬迁及侵袭才能。本试验能够从以下方面进行更进一步的研讨：TWIST是调控EMT的重要转录因子，在乳腺癌及其他肿瘤中，也发现该因子能够增强细胞的搬运和侵袭才能[17]，且很可能与诱导细胞发作EMT有关；而TNF-α能够上调TWIST的表达水平，借此诱导EMT发作改动，还可增强细胞的运动、搬运和侵袭才能；在该病理改动过程中，NF-κB作为关键性的诱导因子，能够增强肿瘤细胞的增殖和生存才能，在其间起至关重要的效果，因而按捺NF-κB表达能够对TNF-α的效果发作按捺效应，进而能够减轻该因子对肿瘤细胞增殖才能的提高效果，因而，能够经过检测NF-κB信号通路的活性、运用免疫荧光、Western blot、细胞转染等多种试验技能，进一步证明TNF-α可能经过激活经典的NF-κB信号通路，然后导致TWIST表达升高，进而诱导细胞发作EMT及增强细胞的搬运才能。
肺鳞癌的发作、开展是多种要素、多种基因参加和效果的成果[18-19]。TNF-α可能经过诱导人肺鳞癌SK-MES-1细胞发作EMT改动而增强肿瘤细胞的运动、搬迁及侵袭才能仅仅其间一种可能的机制，仍需求更多的临床及试验进一步证明。
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（收稿日期：2017-04-18 本文修改：许俊琴）
