黄亦彤+钟志勇+吕永慧+蓝天美+潘竞锵+武昕
摘要：意图经过调查肠炎清对免疫复合溃疡型结肠炎模型（ICUC）大鼠结肠安排Toll样受体4（TLR 4）和核因子-κB（NF-κB）表达的影响，评论肠炎清医治IBD的效果机制。办法选用三硝基苯磺酸（TNBS）加免疫复合法造模。将大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、肠炎清低、中、高剂量组（833、1667、3333mL/kg）、柳氮磺吡啶（SASP）组（05g/kg）。造模后第2 d，用药组别离给予相应药物灌胃7d，给药7天后麻醉处死大鼠，取新鲜结肠标本，选用免疫组化法检测TLR 4、NF-κBp65的表达，实时定量PCR法（qRT-PCR）检测TLR 4mRNA的表达。成果免疫组化成果：NF-κBp65和TLR4在各组各只动物均可见阳性表达，其间肠炎狷介剂量组及SASP组可明显下调NF-κBp65的表达，有计算学差异（P<005）。TLR4在各给药组与模型组比较未见明显差异（P>005）。PCR成果：与模型对照组比较，各给药组大鼠结肠安排TLR4表达均为阳性，但未见计算学差异（P>005）。定论下调TLR4、NF-κBp65的表达，是肠炎清医治IBD的效果机制之一。
关键词：肠炎清；溃疡性结肠炎；ICUC大鼠；TLR4；NF-κBp65
中图分类号：R2855文献标志码：A文章编号：1007-2349（2016）09-0072-04
【Abstract】Objective： To observe the effect of Changyanqing on the colon tissue Toll-like receptor 4 （TLR 4） and nuclear factorκB （NF-κB） expression of immune complexes ulcerative colitis （ICUC） rats and explore its mechanism to treat IBD. Methods： Trinitrobenzene sulfonic acid （TNBS） plus immune complex was used to make models. Rats were randomly divided into a control group， a model control group， Changyanqing groups with low， medium and high dose （833， 1667， 3333mL/kg） and sulfasalazine （SASP） group （0.5g/kg）. In the following the day after modeling， the treatment groups were administered with corresponding drugs for 7 days， and the rats were sacrificed 7 days later to take their fresh colonic samples. Immunohistochemistry was used to detect TLR 4 and NF-κBp65 expression， and RT-PCR method to detect TLR 4mRNA expression. Results： Immunohistochemical results： NF-κBp65 and TLR4 in each group can be seen positive expression， among which the expression of NF-κBp65 of Changyanqing group with high dose and SASP group could be significantly down-regulated， and there are significant differences （P<005）. TLR4 in each treatment group and the model group showed no significant difference （P>005）. PCR Results， compared with the model group， TLR4 expressions of the colon tissue of each administration group were positive， but there was no significant difference （P>005）. Conclusion： Changyanqing can down-regulate TLR4， NF-κBp65 expression， and its mechanism may be related to the regulation of TLR4 / NF-κB signal pathway.
【Key words】Changyanqing， ulcerative colitis， ICUC rats， TLR4， NF-κBp65
属非特异性的自发免疫性疾病，病变首要累及结肠黏膜和黏膜基层，临床首要表现为重复腹痛、腹泻、黏液血便等。其病因和发病机理至今仍不清楚，既往研讨以为，细胞因子网络的失衡在IBD的发作发展中占有极其重要的位置。近年来不少研讨发现，炎症介质及细胞因子可导致机体多条信号通路活化，直接或间接地影响炎症介质的表达，导致肠黏膜受损发作。
肠炎清是由我院自行研发的纯中药制剂，临床用于口服和灌肠医治IBD、缓慢腹泻、结肠息肉电切术后致肠黏膜受损、肠道菌群失调及肠功用障碍等。该药主治以湿热内蕴型为多见的肠炎，或兼有脾胃衰弱、气滞血淤，对受损肠黏膜有明显的医治效果。肠炎清[1]经结肠途径医治，对UC尤其是轻到中度UC 能够明显缩短阶段，削减或避免运用激素及SASP，减轻患者的苦楚。肠炎清在动物炎症模型中表现出杰出的抗炎效应[2-3]。
本研讨选用免疫复合溃疡型结肠炎（ICUC）大鼠模型，经过调查肠炎清对ICUC大鼠TLR4、NF-κBp65表达的影响，评论肠炎清的效果机制。
1材料与办法
11材料
111试验药物肠炎清：广州市中医医院克己，2～8℃保存，批号：151128。柳氮磺吡啶肠溶片：上海信谊天平药业有限公司，批号：09141109生产日期：20141024；有效期至：201610。
112动物SD大鼠48只，雌性180～200g；SPF级；新西兰兔，雄性3kg左右；一般级，由广东省医学试验动物中心供给。大鼠试验动物质量合格证明编号44007200024500，兔试验动物质量合格证明编号44411600001758、44411600001799。
113试剂白腊：茂名市大川特种蜡厂有限公司。环保通明剂：上海宏兹实业有限公司。无水乙醇、95%乙醇、曙红（水溶）：广州中南化学试剂有限公司。苏木素：GEMADA，Biological Stain Commission，Inc。PBS缓冲液：pH72～76、枸橼酸盐缓冲液：pH60，武汉博士德生物工程有限公司。
NF-κB p65 抗体：Arigo Biolaboratories集团公司，TLR4 抗体：罗福斯生物制剂公司，GTVisionTM Ⅲ检测体系/Mo&Rb：基因技能（上海）公司，正常山羊血清：Jackson ImmunoResearch试验公司，定量PCR用的SYBR Green qPCR SuperMix购自Invitrogen公司，
114仪器TS-12C型生物安排全自动脱水机：湖北孝感医用仪器有限公司。EG1150型生物安排包埋机：LEICA，德国。RM2235型轮转切片机：LEICA，德国。CS-VI型摊片烤片机：湖北孝感医用仪器有限公司。BX43型生物显微镜：OLYMPUS，日本。定量PCR仪：ABI PRISM 7500 Sequence Detection System。
CellSens Standard显微图画软件：OLYMPUS，日本。Image-Pro Plus version 60图画剖析软件：Image-Pro 美国。
12办法
121模型树立健康SD大鼠适应性养殖一周后建模，造模前禁食24h。：取50g/L TNBS溶液与50%乙醇溶液以体积比1∶1混合配成25g/L三硝基苯磺酸（TNBS）乙醇溶液；刮取新西兰兔结肠黏膜制成安排匀浆，以3000r/min速度离心30min，取上清液，检测其蛋白含量并调理至20g/L，与等量彻底弗氏佐剂混合配成抗原乳化液，-20℃保存备用。
动物免疫：模型组大鼠悉数于第1天、第14天在大鼠颈、背部打针抗原乳化液（体积为08mL/只动物，含抗原8mg）。第21天，一切大鼠禁食不由水24h，第22天，各组大鼠TNBS乙醇溶液灌肠造模。
造模办法：大鼠戊巴比妥钠麻醉，将一直径20 mm、长约12 cm的塑胶管由肛门轻缓刺进大鼠体内深约8cm，依照TNBS 75mg/kg的剂量，03mL/100g体重的给药体积缓慢注入25g/LTNBS乙醇溶液，然后注入约01mL的空气，将留在塑胶管内的药物排入肠内。给药结束，缓慢拔出塑胶管，用手捏住肛门，提起大鼠尾部，继续倒置1min，使造模剂充沛进入大鼠肠腔内。空白对照组注入等量的生理盐水。验证模型：造模后第2天随机选取4只模型组大鼠麻醉后放血处死，剖腹取直肠和结肠，生理盐水清洗后肉眼调查结肠充血水肿状况，验证模型。
122动物分组及给药选取40只成模大鼠，随机分为5组。造模后第3天各组开端灌胃给药：肠炎清低、中、高剂量组依照833、1667、3333mL/kg（依照人临床用量的5、10、20倍折算）；SASP组按05g/kg；给药体积17mL/100g体重，2次/d，接连7天；空白对照组和模型对照组给予等体积的生理盐水。
123标本处理末次给药后24h，戊巴比妥钠麻醉、放血处死大鼠，开腹，取自肛门向上约10cm结肠段，沿肠系膜纵轴剪开，生理盐水冲刷，取一半用4%中性甲醛固定，用于安排病理和免疫组化查看，另一半液氮速冻，用于PCR检测。
124调查目标及检测办法
1241免疫组化法检测TLR4和NF-κBp65表达安排标本经选材、固定、修切、流水冲刷、脱水、通明、浸蜡、白腊包埋、白腊切片（防脱）、脱蜡至水、抗原修正（微波法）、关闭内源性过氧化物酶、血清关闭、一抗孵育、二抗孵育、DAB显色、苏木素复染、脱水通明、封片。
每张切片扩大400倍随机选取3个视界调查，细胞呈棕黄色为阳性，定位以细胞核为主。用图画剖析软件别离测定各个视界的均匀光密度值，取均值作为每张切片的均匀光密度值。
1242qRT-PCR法检测TLR4mRNA表达[4]Trizol 法提取结肠安排RNA进行qRT-PCR扩增。样品1μl，1%琼脂糖凝胶电泳80V×20min，用凝胶成像体系调查总RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA条带，三条条带完好可证明RNA抽提比较完好。
逆转录：RNase free的PCR管中装备溶液Total RNA10μg+H2O总体积12μl，将溶液吹打均匀，置85℃保温5min，使RNA变性。随后当即冰上致冷，以避免RNA复性；在该PCR管中参加下列试剂Oligo（dT）15 05μl、Random primer（6-mer）05μl、二者浓度都是10uM、dNTP20μl、RNase inhibitor 05μl、5 x buffer 40μl、M-MLV 05μl总体积80μl。将上述20μl反响溶液30℃保温10min；42℃保温60min；85℃保温10min。
定量PCR：检测序列片段。内参片段：GAPDH-200bp，意图片段：TLR4-386bp
引物序列见表1。
并列表阐明，各组数据以均数加减标准差标明（x±s），选用SPSS210计算软件，计量材料数据若方差齐，则选用单因素方差剖析，组间比较用LSD法，若方差不齐，数据经变换后方差仍不齐，选用秩和查验进行计算剖析。
2成果）PCR表达成果（x±s，n=8）：空白对照组：（274±164）；模型对照组：（311±199）；肠炎清低剂量组：（249±156）；肠炎清中剂量组：（318±185）；肠炎狷介剂量组：（359±173）；SASP组：（362±236）。
与空白对照组比较，模型对照组大鼠结肠安排TLR4的表达有所添加，但未见计算学差异（P>005）。与模型对照组比较，各给药组大鼠结肠安排TLR4的表达均有不同程度的下降，但未见计算学差异（P>005）。
3小结
免疫组化法成果显现：NF-κB和TLR4在各组各只动物均可见阳性表达，具体状况如下：
NF-κB：首要表达部位为黏膜层顶端上皮细胞胞浆、肠腺近肠腔侧上皮细胞胞浆、黏膜固有层及黏膜基层结缔安排以及炎性细胞胞浆。模型对照组表达量明显高于空白对照组。各给药组较模型对照组NF-κB表达下调，肠炎狷介剂量组及SASP组NF-κB表达量明显低于模型对照组。
TLR4：首要表达部位与NFκB的表达部位共同，模型对照组表达量明显高于空白对照组，各给药组较模型对照组表达下调，但未见明显差异。
qRT-PCR成果显现：造模后动物结肠安排TLR4mRNA的表达量有所升高，但未见明显差异。与模型组相较，各给药组TLR4mRNA表达均有不同程度的下调，但未见明显差异。
4评论
TLR4是人类发现的第一个TLR相关蛋白，首要表达在参加宿主防护功用的细胞上。TLR4最杰出的生物学功用是促进细胞因子的组成与开释，引发炎症反响。其介导炎症发作的相关机制现在现已研讨得比较透彻，TLR4辨认病原相关分子形式（pathogen-associated molecule pattern，PAMPS）并与之结合，经下流的信号转导通路终究导致 NF-κB 的激活，引发白 细 胞 介 素-1（IL -1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎性因子的开释，介导炎症的发作。
TLR4经过两条经典的信号转导通路激活 NF-κB：My D88 依赖性和My D88 非依赖性信号转导途径。MyD88 是含有TLR 结构域的接头蛋白，是TLR 信号通路的下流信号因子，在TLR 信号通路中有关键性的效果[5-6]。其结构上有3 个功用区域：N 端的逝世区（deathdomain，DD）；与Toll 样受体同源结构域结合的羧基结尾及C 端的类似于IL-1 受体胞质区的Toll 区。DD与白细胞介素-1 受体相关激酶（interleukon-1 receptorassociated kinase，IRAK）的逝世结构域结合，并引起IRAK 的自身磷酸化，再经过一系列的激活反响，终究引起I-κB 的活化，导致NF-κB 的激活和转位，构成炎性细胞因子的组成与开释，然后诱发机体自身的炎症反响进程。
NF-κB在UC的发作、发展中是一种重要的转录因子，是多种信号转导途径的会聚点，在调理炎性反响的基因中起关键效果[7]。试验研讨发现各种与UC相关的细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8可经过发动NF-κB等转录因子诱发或加重机体的炎症反响[8]。NF-κB的激活导致TNF-α、IL-1β转录添加，而TNF-α、IL-1β的开释又进一步激活NF-κB。后者经过正反馈进一步添加TNF-α、IL-1β的排泄，一起使IL-6和IL-8等的表达亦添加。由此发作级联反响，使炎症不断扩大，构成“瀑布效应”。有研讨标明[9]使用NF-κB按捺剂能改动患者的炎症状况。
本研讨成果显现，与模型组比较，肠炎清对TLR4、NF-κBp65蛋白表达、TLR4mRNA表达呈现不同程度下调，其间，肠炎狷介剂量组与SASP组明显下调NF-κBp65表达，证明肠炎狷介剂量组与SASP组相同，对ICUC大鼠能够按捺炎症反响，削减结肠黏膜损害。
由此判别，下调TLR4、NF-κBp65蛋白表达、TLR4mRNA表达，是肠炎清的效果机制之一。但要清晰肠炎清医治IBD的效果靶点，还需要做更为深化和全面的研讨。
参考文献：
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