周红超+陈平+张建博+左晓霜+华杰+范源
摘要：意图测定不同pH条件下的五倍子中EGCG（表没食子儿茶素没食子酸酯）、EGC（表没食子儿茶素）、ECG（表儿茶素没食子酸酯）的含量改变。办法使用反向高效液相色谱法，测定在超声1h条件下五倍子中EGCG，EGC，ECG在不同pH的磷酸缓冲液（pH值别离为2、3、4、5、6、7、8）中的含量改变状况。成果EGCG在缓冲液pH值为2～5和6～8区间呈上升趋势，pH值为5～6区间呈下降趋势，且在pH值为8时含量最高；EGC在缓冲液pH值为2～4和7～8区间呈下降趋势，pH值为4～7区间呈上升趋势，且在pH为2时含量最高；ECG在缓冲液pH值为2～3和4～5区间呈下降趋势，pH值为3～4和5～8区间呈上升趋势，且在pH值为8时含量最高。定论五倍子中EGCG，EGC，ECG在不同pH值条件下的含量有改变，反映了酸碱度对五倍子中EGCG，EGC，ECG含量改变的影响，本试验研讨可为五倍子的理化性质研讨以及质控规范等方面供给必定的参阅。
关键词：RP-HPLC法；五倍子粉；EGCG；ECG；EGC；含量改变
中图分类号：R284文献标志码：A文章编号：1007-2349（2016）09-0078-03
五倍子是瘿绵蚜科（Pemphigidae）五节根蚜亚科（Fordinae）某些蚜虫寄虫瘿。五倍子别号文蛤，百虫仓，木附子等，是生在漆树科（Anacadiaceae）盐肤木属（Rhus L）几种树的复叶上构成的一类产品，五倍子有角倍类，肚倍类，花倍类。始载于《开宝本草》，具有敛肺降火，涩肠止泻，固精缩尿，止汗，止血，解毒，敛疮等多种临床成效，以它为质料的各种产品广泛使用于医药，冶金，食物航天等范畴[1-3]。
五倍子首要有效成分为鞣质，又称鞣酸。因五倍子盛产于我国，国际上又将五倍子鞣质称为我国鞣质，它是倍酰葡萄糖的混合物，即葡萄糖上的羟基与没食子酸所构成的酯类化台物的混合物，属可水解鞣质[4]。五倍子的鞣质含量很高，最高可达70%以上。1994年林余霖等[5]测定了7种五倍子中单宁酸的含量，角倍为4901%，肚倍为6475%圆角倍为6075%，其他几种均在40%左右。没食子酸也是五倍子中首要成分之一，在制药等工业上使用广泛，也是药物中间体，它的含量约占五倍子2%一4%[6]。因为含量小，工业上从五倍子获取的没食子酸首要经过五倍子鞣质的水解取得，它是我国的出口产品之一。五倍子中还含有五倍子油。五倍子油的首要化学成分为癸酸、月桂酸、内豆蔻酸、棕榈酸、硬腰酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等8种；五倍子中含有多种微量元素，包含铜、锌、铁、镁、钠、钙等的化合物；此外，五倍子中还有树脂、脂肪物质、淀粉、蜡质、蛋白质等其他成分。
五倍子中化学成分现已成为研讨热门，李春远等[7]对五倍子的石油醚和氯仿提取物做了别离，总共取得10个化合物，别离为2-羟基-6-十五烷基苯甲酸、白果酚、棕榈酸-1，3-二甘油酯、β-谷甾醇、正二十五烷、3-甲氧基-4-羟基-苯甲酸、棕榈酸、月桂酸、肉豆蔻酸、没食子酸。而五倍子中EGCG，EGC，ECG报导较少。EGCG（表没食子儿茶素没食子酸酯），是从茶叶中别离得到的儿茶素类单体，是茶多酚生物活性的首要成份。纯品为白色粉末，味苦涩、无毒、极易溶于水，能溶于甲醇、乙醇、乙腈和乙酸乙酯，不溶于氯仿。熔点218℃，在空气中易被氧化，变成微粉色，也简单跟着温度的升高而被氧化。EGCG中含多个酚羟基，具有很强的抗氧化和铲除自由基的才能[8]。EGC（表没食子儿茶素），别号：表没食子酸儿茶素；绿茶儿茶酚；L-表没食子儿茶精等。熔点208-210℃。贮存温度2-8℃。EGC中的多酚结构与其抗氧化或促氧化作有关[9-10]。ECG（表儿茶素没食子酸酯）。分子式：C22H18O10。分子量44237[11-12]。纯品为白色粉末。贮存温度2-8℃。酯型儿茶素ECG具有极强的抑菌活性，可能开发成一种天然的类抗生素物质[14]。本试验根据EGCG，EGC，ECG的理化性质，使用RP-HPLC测定在不同pH条件下五倍子中EGCG，EGC，ECG的含量改变。
结构式：
1试验资料与仪器
11试验药品五倍子（角倍，购自昆明道地中药饮片厂 规范：饮片 批号：130801）；EGCG（道斯夫生物479-560-7）；ECG（我国药品生物制品检定所 1257-08-05）；EGC（上海锐谷生物科技有限公司970-74-1）。
12仪器与试剂高效液相色谱仪（Agilent1200 型 VWD检测器）；Agilent C18ZORBAX SB-C18柱（46×250 mm，5 μm）。万分之一剖析天平（北京赛多利斯仪器体系有限公司）；电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司制作）；精细pH测定仪（上海雷磁 PHS-3C型）；循环水真空泵（巩义市英峪予华仪器厂 SHZ-DIII型）；高速多功能破坏机（YB-500A型）；80目筛（5号筛180μm）；电热恒温干燥箱（DHG-9071A型）；超声仪（KUDOS型）；移液管；烧杯；玻璃棒；容量瓶；微孔滤膜（045μm）；打针器（1mL）；无水甲醇（色谱纯）；无水乙醇（剖析纯）；磷酸（剖析纯）；磷酸氢二钠（剖析纯）；冰醋酸（剖析纯）；纯化水。
2试验办法
21磷酸盐缓冲液的制造A液：取磷酸10 mL，加纯化水至100 mL，摇匀。B液：称取磷酸氢二钠7163 g，加纯化水使溶解成100 mL。别离取上述不同体积的A 液和B液混合制造成不同pH（2、3、4、5、6、7、8）的磷酸盐缓冲溶液，即得。
22对照品溶液的制备取EGCG规范品适量，于剖析天平上精细称定，称得29 mg；取ECG规范品适量，于剖析天平上精细称定，称得3 mg；取EGC规范品适量，于剖析天平上精细称定，称得27 mg。别离置于10 mL容量瓶中，加纯净水定容至10 mL。在超声仪中超声溶解，经过045 μm滤膜打针至进样瓶并编号，即得。
23供试品溶液的制备取五倍子样品适量，敲开囊体，去除蚜虫尸身和蚜虫排泄物，用破坏机破坏，过80目筛，于电子天平上别离称取10 g五倍子粉末7份，置于试管中并编号（2，3，4，5，6，7，8），别离参加磷酸盐缓冲液（编号与pH值对应）20 mL，在超声仪中超声1h，用045 μm微孔滤膜抽滤，用1 mL打针器汲取适量对照品溶液，经过滤膜打针至进样瓶并编号，即得。
24色谱条件色谱条件为：Agilent C18色谱柱C18ZORBAX SB-C18柱（46×250 mm，5 μm）；活动相为甲醇：水：冰醋酸（25：74：1）混合液；温度25℃；流速：1 mL/min；波长270nm；进样量：10 uL；时刻：30 min[14]。
25规范曲线的制作
251EGCG规范曲线的制作取EGCG适量于剖析天平上精细称定360 mg，加色谱甲醇溶解制造成定容至10mL，用1 mL打针器汲取适量，经过045 μm微孔滤膜注入进样瓶，按上述EGCG色谱条件别离进样2、4、6、8、10、12 μL，以EGCG的峰面积（Y）对规范品质量（X）进行线性回归，得方程Y=1387X+5172，r=1，成果表明：EGCG峰面积值与浓度有杰出的线性关系，线性规模为：072μg-432 μg。
252EGC规范曲线的制作取EGC适量于剖析天平上精细称定300 mg，加色谱甲醇溶解制造成定容至10 mL，用1 mL打针器汲取适量，经过045 μm微孔滤膜注入进样瓶，按上述EGCG色谱条件别离进样2、4、6、8、10、12 μL，以EGC的峰面积（Y）对规范品质量（X）进行线性回归，得方程Y=3573X+1019，r=09991，成果表明：EGC峰面积值与浓度有杰出的线性关系，线性规模为：06 μg-36 μg。
253ECG规范曲线的制作取ECG适量于剖析天平上精细称定600 mg，加色谱甲醇溶解制造成定容至10 mL，用1 mL打针器汲取适量，经过045 μm微孔滤膜注入进样瓶，按上述ECG色谱条件别离进样2、4、6、8、10、12 μL，以EGCG的峰面积（Y）对规范品质量（X）进行线性回归，得方程Y=1615X-1000，r=09996，成果表明：EGCG峰面积值与浓度有杰出的线性关系，线性规模为：12 μg-72 μg。
26EGCG，EGC，ECG的含量测定别离取23项下办法制备的供试品溶液适量，按24色谱条件别离测定EGCG，EGC，ECG在不同pH的磷酸盐缓冲液条件下的含量，用规范曲线法进行核算。
3试验成果与剖析
31不同pH条件下EGCG，EGC，ECG 的含量改变
在缓冲液pH值为2～3的区间，跟着pH的增大，EGC含量急剧下降；pH值为3～5的区间，跟着pH的增大，EGC含量改变不显着；pH值为5～7的区间，跟着pH的增大，EGC含量逐步添加；pH值为7～8的区间，跟着pH的增大，EGC含量缓慢下降，且当pH值为2时，在所测pH值规模中含量到达最高。如图2
在缓冲液pH为2～3的区间，跟着pH的增大，ECG含量缓慢下降；pH值为3～4的区间，跟着pH的增大，ECG含量缓慢添加；pH值为4～5的区间，跟着pH的增大，ECG含量逐步削减；pH值为5～6的区间，跟着pH的增大，ECG含量逐步添加，且当pH值为8时，在所测pH值规模中含量到达最高。如图3
EGC在pH值为2～3的区间呈显着下降趋势，在pH值为2时含量最高，但酸性强则EGCg，ECG含量较低，当pH值为7时，含量较高且酸碱度在中性；EGCG和ECG在pH值为5～8的区间呈上升趋势，且在pH值为8时两者含量都达所测规模的最高，酸碱度偏中性；在pH值为6～8的区间，EGCG，EGC，ECG含量都呈上升趋势，可能是因为偏碱、超声条件使其提取率添加，还需要做更深一步的研讨。
4定论
五倍子中EGCG，EGC，ECG报导较少。经过测定EGCG，EGC，ECG在不同pH缓冲液中的含量，成果提示：五倍子在pH值为8的缓冲液中EGCG含量最高；五倍子在pH值为2的缓冲液中EGC含量最高；五倍子在pH值为8的缓冲液中ECG含量最高。本试验可认为五倍子进一步的理化性质研讨以及质控规范等方面供给必定参阅。参阅文献：
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