张继峰+雒晓甜+侯林义+姜琴+吕洁萍+张文凯
[摘要] 意图 树立大鼠脓毒症急性肺损害模型，评论骨髓间充质干细胞（BMSCs）在脓毒症大鼠急性肺损害中的肺维护效果及可能机制，为临床医治脓毒症急性肺损害供给新的理论和试验根据。 办法 全骨髓培育法制备BMSCs。36只成年Wistar大鼠（150±15） g随机分为3组，Sham组、CLP组和BMSCs组，每组12只，CLP组和BMSCs组选用盲肠结扎穿孔术（CLP）树立脓毒症急性肺损害模型，盲肠根部丝线结扎，盲肠切断5 mm，肠内容物漏出，将其回归入腹腔，关腹。Sham组大鼠仅翻动盲肠，不结扎穿孔。BMSCs组术后经尾静脉打针BMSCs细胞悬液1 ml（1×106/ml）。试验完毕后，使用ELISA测定血浆IL-10、MIP-2水平，左肺选用Western blot测定肺内NF-κB的表达水平，右肺制造病理切片，HE染色，并在光镜下调查肺安排病理结构改动。 成果 CLP组的血清MIP-2水平显着高于Sham组和BMSCs组，BMSCs组的血清MIP-2水平显着高于Sham组，差异有计算学含义（P＜0.05）；3组的血清IL-10水平比较差异无计算学含义（P＞0.05）；3组的NF-κB表达水平比较差异有计算学含义（P＜0.05）。肺安排病理成果示CLP组和BMSCs组肺内很多炎症细胞滋润、肺间质水肿、肺内出血，BMSCs组症状较CLP组显着减轻。 定论 脓毒症急性肺损害时，血浆MIP-2表达显着升高，肺内出血、水肿、很多炎症细胞滋润。BMSCs经过调控肺内炎症细胞NF-κB入核，使其促炎细胞因子MIP-2表达削减，削减中性粒细胞滋润起肺维护效果，暂不能阐明BMSCs对IL-10有影响。
[关键词] 肺损害；骨髓间充质干细胞；脓毒症；NF-κB；MIP-2
[中图分类号] R631[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721（2014）05（a）-0004-05
Impact study of bone marrow mesenchymal stem cells on NF-κB in rat with acute lung injury
ZHANG Ji-feng1 LUO Xiao-tian1 HOU Lin-yi1 JIANG Qin1 LV Jie-ping2 ZHANG Wen-kai3▲
1.Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2.Department of Anesthesiology,the First Hospital Affiliated to Shanxi Medical University, Taiyuan 030001,China;3.Department of Surgical ICU,the Second Hospital Affiliated to Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China
[Abstract] Objective To establish a rat model of acute lung injury with sepsis,to investigate the protective effect and possible mechanism of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)in acute lung injury with sepsis in order to provide new theoretical and experimental basis in rat of acute lung injury with sepsis in clinic. Methods BMSCs was cultured by whole bone marrow culture.36 adult Wistar rats(150±15) g were randomly divided into three groups(Sham group,CLP group and BMSCs group),12 rats in each group.The method(cecal ligation and puncture(CLP)sepsis established model of acute lung injury,cecal ligation thread roots,cecal incision 5 mm,intestinal contents leaking it back into the abdominal cavity,the abdomen was closed)was used in CLP group and BMSCs group.Just flip the cecum,without ligation and puncture was used in Sham group.BMSCs group was injected via the tail vein BMSCs cell suspension 1 ml(1×106/ml).After the end of the experiment,plasma IL-10,MIP-2 levels were measured by ELISA,NF-κB expression level in lung left was measured by Western blot,the right lung were made in pathological section,HE staining was used and change of lung tissue was observed in the light microscope structure. Results MIP-2 level of CLP group was significantly higher than that of Sham group and BMSCs group respectively,MIP-2 level of BMSCs group was significantly higher than that of Sham group,with statistical difference(P＜0.05).IL-10 of three groups was compared,with no statistical difference(P＞0.05).NF-κB of three groups was compared,with statistical difference(P＜0.05). Conclusion MIP-2 significantly increased when acute lung injury with sepsis,pulmonary hemorrhage,edema and inflammatory cell infiltration.BMSCs lung inflammatory cells can reduce proinflammatory cytokines MIP-2 expression by regulating NF-κB into the nucleus and reduce the infiltration of neutrophils,it plays a protective role in the lung.Temporarily can not explain BMSCs affect IL-10.
[Key words] Lung injury;Bone marrow mesenchymal stem cells;Sepsis;NF-κB;MIP-2
脓毒症急性肺损害是ICU常见危重症，如病情恶化很快开展为急性呼吸困顿综合征，病死率极高，一直是临床医治的难点[1-2]。肺损害时很多炎症细胞在肺内滋润、集合，多种炎症介质、细胞因子在肺内表达增强，抗炎、促炎平衡失调是导致肺损害的关键因素[3-4]。最近研讨标明，骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）可经过再生修正、免疫调节、抗氧化、抗凋亡等减轻急性肺损害炎症反响，是一种极具招引性的新的医治计划[5]。本文选用盲肠结扎穿孔术仿制大鼠急性肺损害模型，经过股静脉打针BMSCs，打针后6 h点评肺损害病理改动、细胞促炎和抗炎因子改动及肺安排NF-κB活性，评论BMSCs在脓毒症大鼠急性肺损害中的肺维护效果及可能机制。
1 材料与办法
1.1 试验材料
1.1.1 试验动物及分组雄性Wistar大鼠6只（3～4周），制备BMSCs。雄性Wistar大鼠36只（150～175 g）随机分为3组，假手术组（Sham组）、脓毒症组（CLP组）和骨髓间充质干细胞医治组（BMSCs组），每组12只。试验大鼠由山西医科大学生理试验室动物中心供给。
1.1.2 首要试剂大鼠MIP-2、IL-10 ELISA试剂盒：北京四柏生物科技有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶、低糖DMEM、双抗、胞核胞浆蛋白提取试剂盒、SDS-PAGE凝胶制造试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、荧光曝光Superstar ECL Plus、辣根过氧化酶羊抗兔二抗：杭州四季青生物工程材料有限公司；TBP pAb兔源多抗核内参（43 kD）、NF-κB P65兔源多抗一抗：Bioworld公司。
1.2 试验办法
1.2.1 BMSCs提取及判定雄性3周左右Wistar大鼠1只，引颈处死，75%乙醇浸泡5 min，剪开皮肤别离大鼠股骨、胫骨，剪开两头，5号针头抽取含10%胎牛血清的低糖DMEM培育液从股骨、胫骨两头重复冲刷骨髓腔，取得细胞悬液4 ml，接种于6 cm细胞培育皿中，37℃、5% CO2培育箱中进行原代培育，48 h后初次换液，去除未贴壁细胞，今后每3～4天换液1次，细胞90%交融后用含EDTA的胰蛋白酶消化传代，至第三代呈不规则梭形（图1）用于试验。BMSCs流式细胞仪剖析CD34阴性（0.92%）、CD44阳性（98.09%）（图2）。
1.2.2 模型制备参照文献[6-8]，将36只大鼠术前12 h禁食，不由水，腹腔打针10%水合氯醛0.3 g/kg麻醉，正中开腹暴露盲肠，CLP组和BMSCs组盲肠远端丝线结扎，近端切断5 mm，使肠内容物漏出，回归入腹腔，关腹缝合，Sham组大鼠仅翻动盲肠，不结扎穿孔。BMSCs组术后立刻经股静脉打针BMSCs细胞悬液1 ml（1×106/ml）。
1.2.3 标本制备术后6 h腹主动脉采血3 ml，置于EP管中，静置2 h，以3000 r/min离心15 min，取其上清－20℃保存，用于MIP-2、IL-10的ELISA试剂盒检测。处死大鼠，剥离肺脏，右下肺放入4%的多聚甲醛溶液中固定，制造病理切片用于调查肺安排病理改动。左肺依照胞核与胞浆蛋白提取试剂盒（博士德公司）阐明书标准操作，提取肺安排胞核蛋白，用于Western blot检测。
1.3 形状学调查及相关目标检测
1.3.1 形状学调查4%多聚甲醛溶液固定肺脏，HE染色光镜下调查肺安排改动。
1.3.2 血浆MIP-2、IL-10含量测定酶联免疫吸附试剂盒（ELISA北京四柏生物科技有限公司），按阐明书标准操作。
1.3.3 肺安排NF-κB（P65）入核 Western blot法测定参照文献[9]，使用核蛋白抽提试剂盒提取肺安排核蛋白，用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳3 h，进口PVDF膜（0.45 μm），2 mA/cm2半干转30 min，加NF-κB p65（Bioworld公司产品）兔抗鼠多克隆抗体（1∶800稀释）4℃摇床过夜，加辣根过氧化酶符号的羊抗兔二抗（1∶2000稀释）室温摇床孵育1 h，Super ECL Plus超敏发光液发光，用TBP pAb作为核内参。曝光后图片选用Photoshop图画剖析软件进行灰度剖析。核算NF-κB与TBP pAb表达的相对灰度比值。
1.4 计算学处理
选用SPSS 19.0计算软件对数据进行剖析和处理，计量材料以x±s标明，选用F查验，以P＜0.05为差异有计算学含义。
2 成果
2.1 3组血清MIP-2、IL-10水平的比较
CLP组的血清MIP-2水平显着高于Sham组和BMSCs组，BMSCs组的血清MIP-2水平显着高于Sham组，差异有计算学含义（P＜0.05）；3组的血清IL-10水平比较差异无计算学含义（P＞0.05）（表1）。
表1 3组血清MIP-2、IL-10水平的比较（pg/ml，x±s）
与CLP组比较，*P＜0.05；与Sham组比较，#P＜0.05
2.2 3组NF-κB（P65）入核检测成果的比较
Sham组的NF-κB表达为（0.26±0.02），CLP组的NF-κB表达为（0.72±0.03），BMSCs组的NF-κB表达为（0.43±0.05），3组比较差异有计算学含义（P＜0.05）。3组的肺安排NF-κB（P65）入核Western blot检测成果见图3。
图3 3组大鼠肺安排NF-κB（P65）入核Western blot检测成果
2.3 3组大鼠肺安排的病理查看成果
Sham组可见大鼠肺泡巨细均匀，结构完好，肺泡上皮细胞形状正常，肺泡距离未见增宽，微血管无充血和淤血，肺间质空隙未见出血、水肿及炎症细胞滋润（图4A）；CLP组可见肺泡交融，肺距离充满增厚，肺间质显着充血、水肿，很多中性粒细胞、巨噬细胞及红细胞滋润（图4B、图4C）；BMSCs组可见肺安排改动比CLP组有所减轻，仍有中性粒细胞滋润，肺呈轻度水肿改动，肺安排结构根本完好（图4D、图4E），标明BMSCs医治后大鼠脓毒症肺损害有必定程度的减轻。
3 评论
脓毒症时炎症细胞（如肺泡巨噬细胞、中性粒细胞等）在肺内滋润、集合，过表达多种炎症介质和细胞因子，导致抗炎和促炎平衡失调，引起全身炎症反响是急性肺损害发病机制的一个关键步骤[10]。脓毒症时劳累肺脏发作炎症或呈现急性呼吸困顿综合征后，都会呈现肺水肿、蛋白漏出、出血、炎症细胞滋润、细小血管损害和血管壁通透性添加。血管内皮细胞激活和中性粒细胞滋润集合是导致病变开展的病理生理根底，激活的中性粒细胞抵达肺脏后，进一步排泄氧化产品、蛋白水解酶、一氧化氮及炎症介质导致肺部损害[11]。脓毒症时前炎症细胞因子的表达，如TNF-α、IL-1不只启动了炎症反响，并且参加保持炎症反响及一些趋化因子的发生，这些因子会活化中性粒细胞及血管内皮细胞，趋化中性粒细胞迁移到肺安排中。研讨已证明小鼠动物模型盲肠结扎穿孔（CLP）模型中，劳累的肺脏MIP-2表达及MPO增高[12-14]。最近研讨标明，肺损害模型中肺泡巨噬细胞排泄并表达C-X-C趋化因子，如MIP-2、核内NF-κB活性显着增高，且与肺功用受损程度密切相关[15-16]。
