石英+张军港+王常玉
[摘要] 意图 评论微管调理蛋白Stathmin对卵巢癌顺铂耐药细胞C13K增殖和化疗灵敏性的影响。 办法 运用蛋白质印记法检测卵巢癌顺铂灵敏性OV2008细胞和耐药性C13K细胞Stathmin表达差异；挑选C13K为试验细胞，运用siRNA靶向缄默沉静Stathmin（Stathmin-siRNA组），以未转染细胞为空白对照组，以转染阴性搅扰为阴性对照组，运用蛋白质印记法检测siRNA转染作用，MTT法测定转染对细胞增殖和顺铂灵敏性的影响，流式细胞仪测定转染对顺铂引起的细胞周期的改变。 成果 Stathmin在细胞C13K的表达较OV2008的表达显着添加。与空白对照组和阴性对照组比较，Stathmin-siRNA组中Stathmin表达显着下降，C13K细胞的增殖显着按捺，Stathmin-siRNA组顺铂对折致死量IC50[（15.41±1.08）μg/mL]显着下降。Stathmin-siRNA组顺铂诱导的G2/M期（27.48±0.76）%显着高于顺铂处理的对照组。 定论 搅扰Stathmin能显着按捺C13K细胞的增殖，增强卵巢癌对顺铂的灵敏性，为卵巢癌医治供给新的远景。
[要害词] Stathmin；卵巢癌；siRNA；增殖；顺铂
[中图分类号] R737.31 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）32-0001-04
Influences of stathmin on C13K cell proliferation and chemosensitivity of cisplatin in ovarian cancer
SHI Ying1，3 ZHANG Jungang2 WANG Changyu3
1.Department of Obstetrics and Gynecology， Zhejiang Provincial Peoples Hospital， Hangzhou 310014， China； 2.Hepatobiliary and Pancreatic Surgery， Zhejiang Provincial Peoples Hospital， Hangzhou 310014， China； 3.Department of Gynecology， Tongji Hospital， Tongji Medical College， Huazhong University of Science and Technology， Wuhan 430030， China
[Abstract] Objective To explore the role of stathmin on the C13K cell proliferation and chemosensitivity of cisplatin in ovarian cancer. Methods The stathmin expression in cisplatin-sensitive OV2008 and resistant C13K cells was detected by western blot. Effective stathmin siRNA was transfected into ovarian cancer C13K cells（Stathmin-siRNA group）. Non-transfected cells were used as blank control and negative siRNA as negative control. Western blot was used to verify the siRNA interference result. MTT was used to measure the cell proliferation and the change of chemosensitivity to cisplatin. Flow cytometry was used to detect the change of cisplatin-induced cell cycle arrest. Results Stathmin expression in C13K cells was higher than that in OV2008 cells. Compared to blank control group and negative control group， Stathmin protein was significantly reduced and the proliferation was significantly inhibited in stathmin-siRNA group， and the IC50 of cisplatin in stathmin-siRNA group [（15.41±1.08） μg/mL] was significantly lower. The cell cycle in G2/M phase induced by cisplatin in stathmin-siRNA group [（27.48±0.76）%] was significantly higher than those in control group. Conclusion Interfering with stathmin can effectively inhibit the proliferation of C13K cell and effectively increase cisplatin chemosensitivity， and provide new prospects for ovarian cancer treatment.
[Key words] Stathmin； Ovarian cancer； siRNA； Proliferation； Cisplatin
卵巢癌是一种常见的严重威胁妇女生命健康的恶性疾病，它的多药耐药性已成为影响患者生计的首要要素之一，因而寻觅新的靶点进行干涉以增强化疗的作用是医治卵巢癌的要害点之一[1，2]。Stathmin是一种重要的微管调理蛋白，能有用调控细胞增殖、细胞周期开展、分解和运动等生物学行为进程[3，4]。Stathmin在多种肿瘤表达上调，下调Stathmin的表达可按捺肿瘤的增殖[5-7]，咱们前期的研讨成果发现Stathmin蛋白在卵巢癌安排中呈显着高表达，与卵巢癌的临床分期、病理分级和淋巴搬运的病理特征密切相关[8]。但Stathmin在体外对卵巢癌细胞的增殖和顺铂灵敏性没有清晰。本研讨想象经过检测卵巢癌顺铂耐药细胞株C13K和顺铂灵敏细胞株OV2008中Stathmin的表达，清晰其表达差异，进而经过干涉Stathmin表达调查卵巢癌细胞增殖和顺铂灵敏性改变，为临床更有用地医治卵巢癌供给理论和试验根据。
1 资料与办法
1.1资料
人卵巢癌OV2008及C13K细胞株由加拿大Ben jam in K，Tsang 博士（Department of Obstetrics and Gynecology and Molecular University of Ottowa）惠赠。Stathmin siRNA 由上海Invitrogen技能有限公司规划并组成，Lipo2000阳离子脂质体购买于上海Invitrogen公司，Stathmin和GAPDH兔抗人一抗均购买于美国Santa Cruz公司。顺铂（DDP）和碘化丙啶（propidium iodine，PI）购买于美国Sigma公司。
1.2 办法
1.2.1 细胞培育 OV2008及C13K细胞用PRMI 1640培育基（含10%胎牛血清）在37℃含5%CO2的细胞培育箱中培育，两种卵巢癌细胞均呈贴壁性成长，选用对数成长期细胞进行试验。
1.2.2 蛋白质印记法检测Stathmin蛋白表达 细胞经SDS蛋白裂解液裂解取得蛋白后，BCA蛋白定量法测定细胞蛋白含量。蛋白变性后取30 μg蛋白上样，运用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后搬运至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉关闭1 h，参加1∶500稀释的一抗4℃孵育过夜，参加1∶2000稀释的二抗室温孵育90 min，ECL增强发光显影，运用Bandscan 5.0图画剖析软件进行光密度积分值剖析。
1.2.3 转染细胞 将处于对数成长期的卵巢癌细胞接种于相应的培育板中（6孔板接种细胞数约为5×105/孔，96孔板约为1×105/孔），PRMI 1640培育基中不能含抗生素；细胞成长到融合度为30%～50%时，按OligofectamineTM Reagent（Invitrogen公司）说明书进程进行寡核苷酸的细胞转染。Stathmin-siRNA和negative RNAi的搅扰序列分别为5'-CUCCAGGGAAAGAUCCUUCUU-3'和5'-CUCAAGCGACGAUAGCUUCUU-3'。运用siRNA靶向缄默沉静Stathmin作为Stathmin-siRNA组，以未转染细胞为空白对照组，以转染阴性搅扰为阴性对照组。
1.2.4 MTT法检测细胞增殖改变 将C13K细胞以5×103/孔接种于96孔板中，细胞贴壁后可进行瞬时转染，每组细胞均设复孔4个，转染24 h、48 h和72 h后在各组细胞中参加MTT溶液（终浓度1 mg/mL），细胞培育箱中避光培育4 h，当心丢掉上层培育液，参加二甲基亚砜（DMSO）150 μL于水平摇床轻摇20 min使其充沛溶解，酶标仪检测波长490 nm处的吸光度值（A）并制作相应增殖曲线。
1.2.5 MTT法检测Stathmin siRNA搅扰对顺铂灵敏性的影响 将C13K细胞以5×103/孔接种于96孔板中，运用不含血清的1640培育液饥饿6 h，转染24 h后参加不同浓度的顺铂（终浓度分别为0 μg/mL、7.5 μg/mL、15 μg/mL、22.5 μg/mL和30 μg/mL）持续培育24 h，每孔参加MTT溶液（终浓度为1 mg/mL）培育4 h，当心丢掉上层培育液，参加DMSO 150 μL，轻摇20 min至结晶完全溶解，酶标仪检测波长490 nm处吸光值，核算对折按捺量数值（IC50）。
1.2.6 流式细胞仪检测细胞周期的改变 将细胞以1×105/孔接种于6孔板中，当细胞到达30%～50%融合度时，按Invitrogen公司操作说明书进行瞬转；转染后48 h细胞融合度能到达70%～80%，加顺铂（终浓度15 μg/mL）持续培育24 h；搜集各处理组细胞，参加70%浓度的冰乙醇固定过夜（-20℃），1200 rpm/min离心5 min，离心半径为10 cm，运用PBS重悬洗刷细胞离心，再参加10 μg/mL PI溶液（含0.1%RNase A）500 μL，室温下避光染色1 h，半小时内流式细胞仪上机测定细胞周期。
1.3 统计学剖析
一切数据重复3次，一切数据运用均数±标准差（x±s）标明，运用SPSS 16.0软件进行统计学处理剖析，两组间数据比较选用Students t-test，多组间数据比较可选用单要素方差剖析和LSD查验，P<0.05以为差异具有统计学含义。
2 成果
2.1 Stathmin在OV2008和C13K细胞中的表达
选用蛋白质印记法研讨发现Stathmin在卵巢癌顺铂耐药细胞株C13K中表达（0.82±0.02）显着高于卵巢癌顺铂灵敏细胞株OV2008（0.18±0.02），差异有显着统计学含义（t=34.80，P<0.01）。见图1。
2.2 Stathmin siRNA搅扰对C13K细胞Stathmin蛋白的影响
与空白对照组（1.69±0.04）和阴性对照组（1.62±0.03）比较，转染Stathmin siRNA至48 h后，C13K细胞中的Stathmin 蛋白表达量均显着下降（0.37±0.02），三者差异有统计学含义（F=1023，P<0.0l）。而空白对照和阴性对照组比较，两者无统计学差异（P>0.05）。见图2。
2.3 siRNA转染对C13K细胞增殖的影响
用MTT法检测空白对照组、阴性对照组、Stathmin-siRNA组细胞增殖改变。成果显现转染siRNA 0 h、24 h、48 h后对细胞的增殖无显着影响；而在转染72 h后，Stathmin-siRNA组细胞的增殖才能（OD=0.55±0.05）显着低于空白对照组（OD=1.35±0.06）及阴性对照组细胞（OD=1.26±0.08），差异具有统计学含义（F=142.6，P<0.01），而空白对照和阴性对照组比较，无统计学差异（P>0.05）（图3）。
图3 转染siRNA对C13K细胞增殖才能的影响
vs空白对照组和阴性对照组，bP<0.01
2.4 siRNA转染对C13K细胞顺铂灵敏性的影响
顺铂作用24 h时对空白对照组的对折致死剂量IC50为（27.22±2.12）μg/mL，阴性对照组的IC50为（25.05±1.29）μg/mL，而Stathmin-siRNA组IC50为（15.41±1.08）μg/mL，三者比较，F=31.04，P<0.01，即Stathmin-siRNA搅扰后能显着进步C13K细胞对顺铂的灵敏性，而与空白对照组比较，阴性对照组的顺铂灵敏性无显着改变，差异无统计学含义（P>0.05）。见图4。
图4 MTT法检测转染前后细胞对顺铂灵敏性的影响
vs空白对照组和阴性对照组，aP<0.05、bP<0.01
2.5 Stathmin-siRNA对顺铂致C13K细胞周期性的影响
细胞转染48 h再经顺铂（15 μg/mL）作用24 h后，与顺铂作用的空白对照组[（4.33±0.34）%]和阴性对照组[（3.31±0.35）%]比较，Stathmin-siRNA组G2/M期细胞显着增多[（27.48±0.76）%]，差异具有统计学含义（F=1362，P<0.01）。一起对G0/G1期的影响无统计学含义（P>0.05），见表1。
表1 转染siRNA对C13K细胞周期的影响（x±s，%）
3 评论
化疗耐药是一个多要素、多环节彼此作用、彼此影响的杂乱进程。既往研讨发现卵巢癌耐药的发作开展受多个基因的重要调控，例如野生型P53的骤变[9]，BRAC1二次骤变[10]，凋亡蛋白按捺分子XIAP[11]等在铂类耐药的发作开展中都发挥了重要作用。Kigawa等研讨发现野生型P53缺失能增强肿瘤对顺铂的耐受，相反，wtP53基因的重建增强了化疗灵敏性[12]。P53的骤变使肿瘤细胞丧失了G1/S检测点的调控，DNA损害修正显着削减，终究增强了顺铂化疗灵敏性[13]。因而寻觅新的基因医治靶点并进行靶向干涉，能有用反转化疗药物的耐受，为卵巢癌的诊治和延伸患者生命供给有利的协助。
Stathmin，是细胞内与细胞周期调控相关的一种重要微管调理蛋白，首要经过磷酸化和去磷酸化进程的彼此切换调理微管体系动力平衡来参加多种肿瘤的发作开展、侵袭搬运及取得性多药耐药等生物学进程，但是它的详细作用机制还未研讨清楚。Wang F等[4]发现Stathmin在食管癌中高表达，与肿瘤分解程度，肿瘤滋润深度，淋巴结搬运和TNM分期密切相关。Xu JP等[14]经过二维电泳技能发现Stathmin在阿霉素化疗耐受的白血病细胞中表达量更高，提出Stathmin 可能与白血病的耐药密切相关[14]。Werner HM等[15]研讨发现Stathmin搅扰后能显着增强子宫内膜癌对紫杉酚的灵敏性，一起Stathmin的高表达的患者承受紫杉酚化疗后其生计率更低[15]。本研讨发现Stathmin在顺铂耐药型卵巢癌细胞中的表达高于化疗灵敏细胞株，这与Balachandran R等[16]的研讨成果相一致[16]，提示Stathmin可能参加了这两种细胞不同的表型差异，在卵巢癌的顺铂耐药中可能起重要作用。
RNA搅扰（RNAi）是运用同源性的双链RNA诱导特异性序列的基因靶向缄默沉静，能快速有用按捺基因的表达及其活性。siRNA是一种具有21～23个碱基的双链RNA小分子搅扰片段，能特异性辨认靶基因的序列，已广泛用于根底试验研讨和部分临床药物的研制进程[17-19]。咱们运用RNA搅扰下调卵巢癌C13K细胞中Stathmin的表达，进而进行相关体外试验研讨。本研讨调查到缄默沉静卵巢癌细胞Stathmin的表达后，细胞的体外增殖才能显着按捺，标明Stathmin参加了调理卵巢癌细胞的增殖及分解，促进肿瘤细胞的成长进程。Stathmin的以上作用可能受PCNA、P53、FOXM1等增殖相关通路的重要调控作用。咱们发现按捺Stathmin的表达能显着下降C13K细胞化疗药物顺铂的IC50值，增强其化疗的灵敏性，提示Stathmin的搅扰片段同化疗可联合运用，进步卵巢癌的医治作用。一起，咱们也发现较低剂量的顺铂能使卵巢癌细胞阻滞在S期，这样的作用一方面可以使DNA的组成显着受阻，另一方面使癌细胞有足够的时刻发动DNA损害修正机制，更简单诱导取得性耐药的发作。Shin SY等[20]研讨发现跨过S期添加G2/M期阻滞能有用添加肿瘤细胞对顺铂的灵敏性。本研讨证明Stathmin的siRNA转染能显着下降顺铂导致的S期阻滞，添加G2/M期细胞份额。由此估测，Stathmin可能经过周期调理分子彼此作用，影响细胞周期检测点功用或DNA损害修正机制，然后影响铂类耐药。当然其详细作用机制还需要进一步研讨。因而，Stathmin不只影响直接作用于微管的化疗药物如紫杉醇等的耐药性，并且对卵巢癌的顺铂耐药也有必定影响。当然，肿瘤的发作开展受多个基因联合调控，独自研讨某一基因或分子关于完全治好肿瘤远远不够，全面研讨并制作微观的基因调控网络图至关重要。
综上所述，搅扰Stathmin的表达可显着按捺卵巢癌细胞的增殖，一起经过促进细胞周期阻滞在G2/M期来增强C13K细胞对顺铂的药物灵敏性，提示Stathmin基因可能是医治卵巢癌的有用靶点。
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（收稿日期：2014-07-24）
综上所述，搅扰Stathmin的表达可显着按捺卵巢癌细胞的增殖，一起经过促进细胞周期阻滞在G2/M期来增强C13K细胞对顺铂的药物灵敏性，提示Stathmin基因可能是医治卵巢癌的有用靶点。
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（收稿日期：2014-07-24）
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（收稿日期：2014-07-24）
