苏岁月+李付贵
[摘要]意图 评论荧光原位杂交（FISH）技能在检测早孕期天然流产胚胎安排染色体数目反常中的运用价值。办法 搜集早孕期流产胚胎安排样本396例，运用13/21、16/22及18/X/Y三组特异性DNA探针进行FISH检测，剖析7种染色体数目反常的成果。成果 396例标本FISH检测均成功，流产胚胎染色体数目反常187例（47.22%）。在反常标本中，XXYY 3例，单倍体4例，三倍体86例，四倍体1例和嵌合体93例；检出频率最高的反常类型是13/21三体/四体（26.20%），其次为16三体（21.93%）和22三体（8.56%），其他类型检出频率均低于5%。孕妈妈高龄（≥35岁）组染色体反常发生率显着高于非高龄（<35岁）组。定论 经过对早孕期流产胚胎安排进行FISH检测，能够开始了解流产或死胎的原因，对有流产史特别是不明原因重复流产孕妈妈的再次妊娠和产前确诊具有重要的辅导含义。
[关键词]早孕期；天然流产；胚胎；染色体；FISH
[中图分类号] R446.8 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）06（c）-0015-04
[Abstract]Objective To discuss the application value of FISH in detecting numerical abnormalities of chromosomes in embryonic tissue of spontaneous abortion at early pregnancy.Methods 396 embryonic tissue samples of spontaneous abortion at early pregnancy were collected and detected by FISH using 13/21，16/22 and 18/X/Y specific DNA probes.The results of seven numerical abnormalities of chromosomes were analyzed.Results The detections of 396 samples by FISH were all successful，and there were 187 cases （47.22%） of numerical abnormalities of chromosomes.Among the abnormal samples，there were 3 cases of XXYY，4 cases of haploid，86 cases of triploid，1 case of tetraploid，and 93 cases of chimera.The most frequently detected abnormal type was 13/21 triploid/tetraploid （26.20%），followed by 16 triploid （21.93%） and 22 triploid （8.56%）.The detected frequencies of other types were all below 5%.The incidence rate of numerical abnormalities of chromosomes in the advanced maternal age （≥35 years old） group was significantly higher than that in the non-advanced materhal age （<35 years old） group.Conclusion By FISH detection on embryonic tissue of spontaneous abortion at early pregnancy，the reason for abortion or stillbirth can be initially revealed，which has important guiding significance for subsequent pregnancies and prenatal diagnoses to women with abortion history，especially those with unexplained recurrent abortion.
[Key words]Early pregnancy；Spontaneous abortion；Embryo；Chromosome；FISH
跟着社会的开展，产前确诊越来越受到注重。在产前确诊进程中，常常有孕妈妈反映有流产史特别是前期流产史[1]。在一切妊娠中，天然流产占10%～15%，其间有50%～60%的流产是因为早孕期胚胎发育进程中染色体反常所构成的[2-3]。因而，经过荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技能检测的流产胚胎安排的染色体反常状况，咱们能够了解流产的原因和有用辅导再次妊娠。本研讨选用13/21、16/22及18/X/Y三组特异性DNA探针，对396例早孕期天然流产的胚胎安排标本进行FISH检测，并对其成果进行剖析，评论FISH技能在查找早孕期天然流产原因中的运用价值。
1材料与办法
1.1一般材料
依据知情赞同准则，挑选2010年1月～2016年3月396例经中山市人民医院确诊为早孕期天然流产的胚胎安排样本作为研讨目标，扫除夫妻两边染色体反常、生殖器器质性病变、支原体和衣原体感染、免疫反常、内分泌疾病以及显着的环境污染等要素。依据孕妈妈年纪分为高龄组（≥35岁）和非高龄组（<35岁）。
1.2首要仪器与试剂
Olympus荧光显微镜，ThermoBrite主动杂交仪，恒温水浴箱，电子剖析天平，烤片机，水平离心机；13/21、16/22及18/X/Y探针试剂盒均购于北京金菩嘉医疗科技有限公司。
1.3办法
1.3.1选材 选取在手术室无菌操作清宫手术下取出或自行排出的流产安排标本约10 g，放入已装有20 ml生理盐水的离心管中及时送检。
1.3.2 FISH操作 ①把流产胚胎安排倒入直径10 cm的培育皿里，用生理盐水冲刷两遍，用眼科剪剪下绒毛，将之尽量剪碎后转移到15 ml尖底离心管中。②参加经37℃预热的0.075 mol/L KCl 6 ml用力吹打，置于37℃恒温水浴箱低渗30 min（中心吹打两次）。③加固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）2 ml，轻柔吹打混匀，37℃预固定10 min。④离心去上清，加固定液6 ml再次轻柔吹打混匀，离心弃上清液；再重复固定离心弃上清，然后制备细胞悬液，滴片。⑤75℃烤片30 min后进行FISH试验。⑥杂交后经56℃ 2×SSC洗刷5 min→0.1%NP40洗刷5 min。⑦取出玻片晒干，加l0 U LDAPI复染。⑧在荧光显微镜调查成果，16号、21号、Y染色体在显微镜下呈橘红色荧光信号，13、22、X染色体呈绿色荧光信号，18号染色体呈天蓝色荧光信号。挑选布景洁净、细胞核内信号巨细中等、明晰亮堂无堆叠、信号距离>信号直径的细胞，计数200个细胞内FISH的杂交信号，摄影进行图画组成并剖析7种染色体数意图状况。判读规范如下：①每组探针计数至少100个细胞；②独自判别每一目标，正常细胞份额>90%，反常细胞份额均<10%，提示该目标无反常；③某一目标反常细胞份额>60%，提示该目标反常；④假如某一目标反常份额介于10%～60%，则加大细胞计数至200个细胞，照实记载反常细胞份额，提示为嵌合体。
1.3.3计算学办法 选用直接计数法计算各反常染色体类型的检出频率；选用SPSS 13.0计算软件对数据进行剖析，计数材料选用χ2查验，以P<0.05为差异有计算学含义。
2成果
2.1 FISH非整倍体的检测成果
在396例早孕期天然流产的胚胎安排样本中，染色体数目反常187例（47.22%），共检出26种反常类型。187例反常标本中，包含XXYY 3例，单倍体4例，三倍体86例，四倍体1例和嵌合体93例；检出频率最高的反常类型是13/21三体/四体嵌合体（26.20%），其次为16三体（21.93%）和22三体（8.56%），其他类型检出频率均低于5%（表1、图1）。
2.2高龄组与非高龄组胚胎安排染色体反常发生率的比较
高龄组前期天然流产患者80例，其间47例为染色体非整倍体，反常发生率为58.75%；非高龄组天然流产患者316例，其间140例为染色体非整倍体，反常发生率44.30%。两组的染色体反常发生率比较，差异有计算学含义（P<0.05）（表2）。
2.3流产次数与胚胎安排染色体反常发生率的比较
初度天然流产185例，染色体反常85例，反常发生率占45.94%，复发性流产（流产次数≥2次）211例，染色体反常102例，反常发生率占48.34%，两组的染色体反常发生率比较，差异无计算学含义（P>0.05）（表3）。
3评论
近年来，因为环境要素及高龄妊娠等原因，早孕期天然流产的发生率呈增高趋势，是临床妇产科中最常见的疾病之一，严重影响妊娠妇女的身心健康[4-5]。研讨标明，流产胚胎染色体反常占一切天然流产的50%左右，是构成天然流产的首要原因[6]。流产胚胎的遗传学检测办法有核型剖析、FISH、PCR、MLPA等技能，但各有长处与缺乏[7]。细胞遗传学核型剖析技能是检测染色体反常的“金规范”，是传统、安全牢靠的确诊办法，既能检测46条染色体的数目反常，也能检测结构反常（>5 Mb），其成果相对直观、牢靠与全面；可是，该办法具有必定的局限性，譬如对操作者技能要求高、试验耗时长、培育进程易受污染等[8-9]。相关于细胞遗传学核型剖析技能，FISH技能是使用DNA碱基互补配对，把荧光符号的DNA探针和与其互补的意图DNA进行杂交，依据杂交信号的有无及类型来确诊染色体反常类型。该办法无需进行培育，操作简洁、快速，既能够剖析中期割裂相细胞又能够检测间期细胞，简单被孕妈妈及其家族承受，而且可较快缓解因为流产带来的焦虑心情[10-11]。
本研讨中，流产胚胎染色体非整倍体反常占早孕期天然流产标本的47.22%，与以往文献[12-13]报导根本契合。导致该反常的原因可能是源自双亲之一方的配子构成时或妊娠初期受精卵卵裂时呈现了某号染色体不别离，导致该染色体增多或削减一条，亦即导致三体性或单体性[14-15]。在本研讨中，16三体在一切三体型的发病率为47.67%（41/86），与何地理等[16]报导的染色体反常发病率为41.68%挨近。此外，在本区域染色体非整倍体反常的187病例中以13/21三体/四体嵌合体最为常见，这可能是因为每个区域判读成果的参考值规模不一样所构成的。
跟着当时社会婚龄和育龄的推延，加上女人>35岁机体处于下滑趋势，胎儿变形的发生率和胚胎染色体非整倍体反常的发生率可能有所增加。在本研讨中，高龄组孕妈妈的流产胚胎染色体反常率与非高龄组孕妈妈的差异有计算学含义，这跟以往的报导[17]成果是共同的。这可能是因为高龄孕妈妈体内生殖细胞退化，如卵子质量下降，或许跟着年纪的增加，男方精子的数量与质量下降（这一原因往往易被忽视）和其他归纳要素等引起胚胎的染色体发育反常所构成的。
van den Berg等[18]经过对1359例天然流产标本进行细胞遗传学核型剖析发现，初度流产的胚胎安排染色体反常发生率明显高于复发性流产，可是在本研讨却未发现两者染色体反常发生率差异有计算学含义，有可能是van den Berg所选用的检测办法和本研讨所选用的办法不一样或许与本研讨病例数少有关。关于流产次数与胚胎安排染色体反常发生率的相关性，咱们将进一步研讨。
综上所述，流产胚胎安排染色体非整倍体反常是导致前期天然流产的重要原因之一，高龄孕妈妈的流产危险比非高龄孕妈妈高。因而，咱们应注重并依据FISH检测成果为天然流产孕妈妈及时提出利于再次妊娠的主张和供给有用的干涉。一起，咱们也要认识到FISH技能的缺乏之处，该办法只能检测常见型染色体数意图反常，未能检测其他稀有型染色体反常和结构反常[19-20]。尽管FISH技能无法彻底替代传统的染色体核型剖析，可是其能够成为绒毛染色体核型剖析的一个很好的弥补，主张两者结合运用于临床。
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