郑悦康 叶志英 刘绮明
[摘要] 意图 树立使用微生物法试剂盒检测奶粉中维生素B6含量的剖析办法。 办法 选用维生素B6微生物检测试剂盒定量检测奶粉中增加维生素B6的含量。 成果 维生素B6的线性规模为0.002～0.012 mg/100 g（ml），检出限为0.002 mg/100 g（ml），其规范曲线的相关系数为0.9987，相对规范偏差均<10%，其收回率到达90.0%～108%。 定论 微生物法试剂盒具有灵敏度高，检出限低，线性规模宽，操作办法简洁、方便，成果精确牢靠等长处，可用于奶粉中维生素B6的检测作业。
[关键词] 维生素B6；吡哆醇；微生物法
[中图分类号] R155.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）02（a）-0012-03
维生素B6是一切出现吡哆醛生物活性的3-羟基-2-甲基吡啶衍生物的总称，首要是吡哆醛、吡哆胺和吡哆醇，在自然界广泛散布，其磷酸化方式是氨基酸代谢进程的辅酶，如转氨酶的辅酶。参加食物中的维生素B6一般为盐酸吡哆醇或5-磷酸吡哆醇方式，5-磷酸吡哆醇也以维生素B6衍生物的方式天然存在于食物中。首要临床使用有：维生素B6缺乏症、婴儿惊厥、血红蛋白缺点所造成的的贫血、放射病及某些抗癌药物引起的厌恶、吐逆或妊娠吐逆的医治[1]。据报道每天弥补40 mg维生素B6能够避免动脉粥样硬化的开展。研讨标明，当维生素B6到达必定血药浓度时，还能够与血小板外表蛋白质、纤维蛋白原及凝血酶原等凝血物质结合，然后阻挠血小板集合，避免血液凝结，延伸凝血时刻，使血栓不易构成，因而具有防备脑血栓的药理作用[2]。现在，市场上出售的奶粉成分中一般都含有维生素B6，特别在婴幼儿配方奶粉中是必需增加的一种维生素。测定食物中维生素B6的办法有化学法和生物法，化学法首要是仪器剖析如液相色谱法[3-4]、气相色谱法[5]、荧光光度法[6-7]、紫外分光光度法[8-9]等。生物法也叫微生物法，其优势则在于：①它是以使用微生物试验目标为根底，测的是生物活性含量，更具生物学含义；②微生物作为一种活试剂，具有本身的特异性和高度的灵敏性，使测定成果较化学办法更为精确。依据这些原因，GB/T5009.154-2003将微生物法规定为测定食物中维生素B6的国家规范办法[10-11]。
本次研讨所用的试剂盒使用微生物法的原理，将维生素B6检测培养基和稀释后的样品提取液参加包被有酿酒酵母的微孔中。酿酒酵母的成长离不开维生素B6，参加维生素B6规范品或含维生素B6的样品后，酿酒酵母开端成长直至维生素被彻底耗费。30℃避光44～48 h彻底孵育。酿酒酵母的代谢或成长强度与提取液中维生素B6的含量有关，可经过在610～630 nm或540～550 nm下选用酶标仪读取溶液混浊度取得，将样品浊度与规范曲线比照即可得到样品中维生素B6含量。
1 资料与办法
1.1 仪器
Sunrise酶标仪（奥地利TECAN）、电子剖析天平（上海梅特勒）、离心机（上海安亭）、恒温培养箱（德国BINDER）。
1.2 试剂
VitaFast维生素B6（吡哆醇）检测试剂盒（北京博欧实德生物技术有限公司供给）；盐酸吡哆醇（维生素B6）纯度规范物质（纯度99.7%，我国计量科学研讨院出产）；酸性马铃薯磷酸酶（美国Sigma出产）；枸橼酸盐缓冲液（pH4.5）：将1.5 g枸橼酸一水化合物参加100 ml烧杯中，参加50 ml无菌水，边拌和边溶解，然后参加12 ml NaOH（1 mol/L），用0.1 mol/L HCl将pH调至4.5，将溶液定量转移至100 ml容量瓶中，用无菌水定容；试验用水均为灭菌超纯水；样品均为市售奶粉。
1.3 规范样品的制备
1.3.1 规范储藏液 精确称取盐酸吡哆醇（维生素B6）纯度规范物质0.050 g，用枸橼酸盐缓冲液溶解并定容至100 ml棕色容量瓶中，配成50 mg/100 ml溶液，置于冰箱中保存以备用。
1.3.2 规范作业液 在测守时，将规范储藏液按份额用枸橼酸盐缓冲液精确稀释成浓度为10 mg/100 ml、25 mg/100 ml。
1.4 样品处理
精确称取1 g均质后的样品，将其参加50 ml无菌离心管中，参加20 ml枸橼酸盐缓冲液，振动混匀，参加10 mg酸性马铃薯磷酸酶，振动混匀，37℃避光孵育1 h，一起刻歇性振动，用无菌水补至40 ml。振动混匀后，在95℃水浴中提取30 min，期间应至少混合5次，然后快速冷却至30℃以下，在>8000 g下离心5 min。依据维生素B6的浓度规模，在1.5 ml无菌离心管中使用无菌水对上清液进一步稀释成100倍或以上，使测定OD值在规范曲线规模内。
1.5 检测进程
取出所需数量的微孔板条并在板上固定，顺次将150 μl维生素B6检测培养基、150 μl规范品或样品稀释液参加微孔中，用黏合箔盖住微孔条或微孔。在30℃培养箱中避光孵育44～48 h。再次向下揉捏黏合箔，将微孔板向上放置在桌面上，在桌面平面上振动，使微生物溶解在培养基中。当心揭开黏合箔，用移液枪头损坏微孔液体外表一切的泡沫。用酶标仪在620 nm条件下丈量浑浊度。
1.6 成果核算
使用4参数法进行成果核算。4参数法是指用含有4个参数的方程标明因变量（Y）随自变量（X）改变的规则。现在最常用于免疫检测范畴，用于描绘吸光度随抗原浓度改变的规则，四参数形式为Y=D+（A-D）/[1+（X/C）^B]。
2 成果
2.1 规范曲线的制作
别离移取维生素B6的规范品浓缩液（试剂盒自带）按份额稀释成规范系列浓度别离为0.002、0.004、0.006、0.008、0.012 mg/100 g。以规范系列中的维生素B6浓度为横坐标，酶标仪的丈量OD值为纵坐标制作维生素B6的规范曲线（图1）。4参数曲线法线性回归方程为Y=-0.012 763 0+（1.530 362 86+0.012 276 30）/[1+（X/0.006 597 79）^（-1.455 190 92）]，其相关系数为0.9987。
图1 维生素B6的规范曲线
2.2 办法的精密度剖析
将进行样品处理的4种不同的奶粉样品别离进行6次维生素B6测定，得出不同样品的相对规范偏差（RSD）值（表1）。
表1 精密度剖析（n=6）
2.3 办法的加标收回率
将两种不同的奶粉样品，别离参加质量浓度为10、25、50 mg/100 ml的维生素B6规范溶液各10 μl，再按样品处理的进程进行处理，然后平行测定6次，得到不同样品的加标收回率（表2）。
表2 加标收回试验（n=6）
3 评论
因为维生素B6是水溶性维生素，在高温、光线直射、空气露出等环境条件下，会部分降解丢失，故在样品提取操作进程中，要尽可能在避光条件下操作，规范溶液应在冷藏、避光条件下保存并赶快剖析。含样品的微孔板在30℃培养箱中避光孵育后，将其放于2～8℃冰箱保存，别离于24、48、72 h取微孔板用酶标仪在620 nm条件下丈量浑浊度，成果显现48 h内微孔板中的维生素B6性质安稳。
参加微孔中的样品提取液，样品稀释液用水，以及试验中需求的其他耗材都必须无菌。样品无菌提取后，也必须在无菌环境中进行操作。要确保黏合膜和微孔的封闭性，特别注意微孔的边际部分，避免样品液在振动进程中彼此混合影响丈量成果。检测样品前要预算样品中维生素B6的含量进行稀释，稀释进程要精确，样品的丈量OD值在规范曲线中部的成果可信度较高。
微生物法测定维生素B6的含量近50年来尽管已被广泛地归入各类国际规范办法中，但在我国使用却很少。微生物法操作繁琐、试验周期长，与现在剖析办法简洁、快速、高效的开展方向所不符[12]。因而，微生物检测试剂盒经过优化样品处理、试剂制造、反响条件，省掉了菌种保存及种子培养液的制备[13]，能有效地简化试验进程，扫除试验进程中的各种搅扰，然后到达节约试验时刻、减轻作业量，进而得到精确的定量成果的意图，一起该办法检出限、线性关系、精密度、加标收回率、安稳性等技术参数能满意奶粉中维生素B6的微量剖析的要求，标明该办法可用于测定奶粉中维生素B6的含量，成果令人满意。
[参考文献]
[1] 陈汝杰.维生素B6临床使用新进展[J].我国临床医师，2010，38（11）：26-27.
[2] 陈伟，王颖.维生素B6的新途径[J].公民军医，1994，13（9）：69-70.
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[4] 宋萍萍，曹江平，刘书慧.反相高效液相色谱法测定果醋中的8种维生素[J].食物科学，2012，33（12）：181-184.
[5] 陈凤恩，赵文超，汪帆.维生素B6中间体的气相色谱剖析[J].我国医药工业杂志，2002，33（5）：241-242.
[6] 谢秀娟，张振新.离子液体双水相萃取荧光法测定维生素B6[J].剖析科学学报，2011，27（4）：513-515.
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[8] 曹高娃，崔毅，张力.紫外分光光度法测定维生素B6 [J].光谱试验室，2001，18（6）：802-803.
[9] 陈恕华.紫外分光光度法测定维生素B6[J].理化查验：化学分册，2005（7）：519，521.
[10] GB/T5009.154-2003.食物中维生素B6的测定[S].
[11] 王为黎，马景宏，张旭，张志宏.运用微生物法测定保健食物中的维生素B6[J].我国微生态学杂志，2006，18（4）：291-295.
[12] 张旭，李援，胡英.微生物剖析办法测定保健食物中维生素B6的含量[J].我国微生态学杂志，2005，17（6）：477-478.
[13] 陈亚波，周敏，杨彤.微生物法测定维生素饮猜中的维生素B6[J].安徽农业科学，2013，41（12）：5502-5503，5509.
（收稿日期：2013-12-02 本文修改：郭静娟）
图1 维生素B6的规范曲线
2.2 办法的精密度剖析
将进行样品处理的4种不同的奶粉样品别离进行6次维生素B6测定，得出不同样品的相对规范偏差（RSD）值（表1）。
表1 精密度剖析（n=6）
2.3 办法的加标收回率
将两种不同的奶粉样品，别离参加质量浓度为10、25、50 mg/100 ml的维生素B6规范溶液各10 μl，再按样品处理的进程进行处理，然后平行测定6次，得到不同样品的加标收回率（表2）。
表2 加标收回试验（n=6）
3 评论
因为维生素B6是水溶性维生素，在高温、光线直射、空气露出等环境条件下，会部分降解丢失，故在样品提取操作进程中，要尽可能在避光条件下操作，规范溶液应在冷藏、避光条件下保存并赶快剖析。含样品的微孔板在30℃培养箱中避光孵育后，将其放于2～8℃冰箱保存，别离于24、48、72 h取微孔板用酶标仪在620 nm条件下丈量浑浊度，成果显现48 h内微孔板中的维生素B6性质安稳。
参加微孔中的样品提取液，样品稀释液用水，以及试验中需求的其他耗材都必须无菌。样品无菌提取后，也必须在无菌环境中进行操作。要确保黏合膜和微孔的封闭性，特别注意微孔的边际部分，避免样品液在振动进程中彼此混合影响丈量成果。检测样品前要预算样品中维生素B6的含量进行稀释，稀释进程要精确，样品的丈量OD值在规范曲线中部的成果可信度较高。
微生物法测定维生素B6的含量近50年来尽管已被广泛地归入各类国际规范办法中，但在我国使用却很少。微生物法操作繁琐、试验周期长，与现在剖析办法简洁、快速、高效的开展方向所不符[12]。因而，微生物检测试剂盒经过优化样品处理、试剂制造、反响条件，省掉了菌种保存及种子培养液的制备[13]，能有效地简化试验进程，扫除试验进程中的各种搅扰，然后到达节约试验时刻、减轻作业量，进而得到精确的定量成果的意图，一起该办法检出限、线性关系、精密度、加标收回率、安稳性等技术参数能满意奶粉中维生素B6的微量剖析的要求，标明该办法可用于测定奶粉中维生素B6的含量，成果令人满意。
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[13] 陈亚波，周敏，杨彤.微生物法测定维生素饮猜中的维生素B6[J].安徽农业科学，2013，41（12）：5502-5503，5509.
（收稿日期：2013-12-02 本文修改：郭静娟）
图1 维生素B6的规范曲线
2.2 办法的精密度剖析
将进行样品处理的4种不同的奶粉样品别离进行6次维生素B6测定，得出不同样品的相对规范偏差（RSD）值（表1）。
表1 精密度剖析（n=6）
2.3 办法的加标收回率
将两种不同的奶粉样品，别离参加质量浓度为10、25、50 mg/100 ml的维生素B6规范溶液各10 μl，再按样品处理的进程进行处理，然后平行测定6次，得到不同样品的加标收回率（表2）。
表2 加标收回试验（n=6）
3 评论
因为维生素B6是水溶性维生素，在高温、光线直射、空气露出等环境条件下，会部分降解丢失，故在样品提取操作进程中，要尽可能在避光条件下操作，规范溶液应在冷藏、避光条件下保存并赶快剖析。含样品的微孔板在30℃培养箱中避光孵育后，将其放于2～8℃冰箱保存，别离于24、48、72 h取微孔板用酶标仪在620 nm条件下丈量浑浊度，成果显现48 h内微孔板中的维生素B6性质安稳。
参加微孔中的样品提取液，样品稀释液用水，以及试验中需求的其他耗材都必须无菌。样品无菌提取后，也必须在无菌环境中进行操作。要确保黏合膜和微孔的封闭性，特别注意微孔的边际部分，避免样品液在振动进程中彼此混合影响丈量成果。检测样品前要预算样品中维生素B6的含量进行稀释，稀释进程要精确，样品的丈量OD值在规范曲线中部的成果可信度较高。
微生物法测定维生素B6的含量近50年来尽管已被广泛地归入各类国际规范办法中，但在我国使用却很少。微生物法操作繁琐、试验周期长，与现在剖析办法简洁、快速、高效的开展方向所不符[12]。因而，微生物检测试剂盒经过优化样品处理、试剂制造、反响条件，省掉了菌种保存及种子培养液的制备[13]，能有效地简化试验进程，扫除试验进程中的各种搅扰，然后到达节约试验时刻、减轻作业量，进而得到精确的定量成果的意图，一起该办法检出限、线性关系、精密度、加标收回率、安稳性等技术参数能满意奶粉中维生素B6的微量剖析的要求，标明该办法可用于测定奶粉中维生素B6的含量，成果令人满意。
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[9] 陈恕华.紫外分光光度法测定维生素B6[J].理化查验：化学分册，2005（7）：519，521.
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（收稿日期：2013-12-02 本文修改：郭静娟）
