杨晨+杨林花+张耀方+张睿娟+葛晓燕+任方刚
[摘要] 意图 评论CD25与急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）的常见免疫表型符号间的相关性，及CD25与FLT3-ITD基因的联络。 办法 经过流式细胞术检测CD7、CD117、CD33、CD34、CD38、cyMPO、CD13、CD36、CD56、CD11b、CD19、CD16、CD14、CD64及白介素2三条受体链CD25（α链）、CD122（β链）、CD132（γ链）在36例AML患者骨髓表达，运用PCR技能检测本组患者FLT3-ITD基因的表达。成果 36例AML患者中， CD25+表达率为13.89%（5/36），在AML-M2组为12.5%（1/8）、AML-M4组为18.18%（2/11）、AML-M5组为20%（2/10），CD25+表达率在各组间不同无统计学含义（P>0.05）。表达CD7、CD117、CD33、CD34、CD38、cyMPO、CD13、CD36、CD56、CD11b、CD19、CD16、CD14、CD64、CD122、CD132单克隆抗体的骨髓原始细胞百分比在CD25+AML-M2组和CD25-AML-M2组间、CD25+AML-M4组和CD25-AML-M4组间、CD25+AML-M5组和CD25-AML-M5组间无统计学差异（P>0.05）。PCR成果显现，7例AML患者呈现FLT3-ITD骤变基因，5例CD25+AML患者组中FLT3-ITD+者为3例，CD25+AML兼并FLT3-ITD+率为60%，高于CD25-AML组（P<0.05）。 定论 （1）CD25在AML患者中可呈现阳性表达，但阳性率较低，CD25与AML患者的FAB亚型和常见的髓系免疫表型符号无显着相关性；（2）CD25+AML患者兼并FLT3-ITD基因骤变率较高，清晰CD25与FLT3-ITD基因的相关性有必定临床含义。
[关键词] CD25；急性髓细胞白血病；FLT3-ITD基因；流式细胞术
[中图分类号] R733.71 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）14-0020-04
急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）以分解阻滞的不成熟细胞很多集合于骨髓为特色，临床常经过查看骨髓细胞形状、免疫符号和遗传学剖析对患者进行确诊。CD25是高度亲和白细胞介素2的受体α链，可参加按捺CD4+CD25+T细胞增殖，使AML患者对白血病细胞的免疫效果缺点。已有研讨提出，CD25可表达率在Ph+ALL显着添加，并提示疾病预后不良[1]。本研讨经过流式细胞术检测CD25在AML患者骨髓内的表达状况，评论其与常用的试验室免疫符号的联络和FLT3-ITD基因骤变分子的潜在联络。
1 材料与办法
1.1临床材料
挑选我院36例初诊AML患者，男21例，女15例，年纪15～63岁，中位年纪39岁；均匀白细胞计数（WBC）为（11.5±8）×109/L，均匀血红蛋白浓度（Hb）为（83±12.3）g/L，均匀血小板计数（PLT） （48±15.7）×109/L，骨髓原始细胞份额（Marrow blast%）为（89±7）%；参照《血液病确诊及医治规范》[2]对一切病例进行细胞形状学、免疫学、细胞遗传学和分子遗传学（MICM）查看，其间AML-M1 2例，AML-M2 8例，AML-M3 4例，AML-M4 11例，AML-M5 10例，AML-M7 1例。
1.2 PCR检测
按DNA提取试剂盒（购自TIANGEN）阐明书操作。汲取与EDTA抗凝剂混合的骨髓液200 μL，参加20 μL蛋白酶K，混匀。加200 μL缓冲液GB，充沛混匀，于56℃恒温水浴箱放置10 min以上，必要时延长时刻使溶液变清亮。加500 μL无水乙醇吹打混匀，若液体黏稠，可再加无水乙醇200 μL，此刻可能见到絮状沉积。将吸附柱CB3放入搜集管并编号，12 000 rpm离心1 min，若调查到吸附柱阻塞，可将阻塞物吸出后再离心。弃掉搜集管中的废液，将吸附柱放回搜集管，参加500 μL缓冲液GD，12 000 rpm离心1 min，弃掉搜集管中的废液。吸附柱放回搜集管，参加700 μL漂洗液PW，12 000 rpm离心1 min，丢掉废液后吸附柱放入搜集管。加500 μL漂洗液PW，12 000 rpm离心30 s，丢掉废液后吸附柱放入搜集管。12 000 rpm离心2 min，倒掉废液。吸附柱转移至洁净的离心管，向吸附膜中心方位悬空滴加100 μL去离子水，室温放置2～5 min，12 000 rpm离心2 min，将溶液搜集到离心管，作为FLT3-ITD扩增的DNA模板。引物由上海生工生物工程股份有限公司规划组成，FLT3-ITD的上游引物5'-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3'，下流引物5'-CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC-3'。反响体系为上、下流引物各1 μL，DNA模板2 μL，PCRmix10 μL（购自Takara公司）。PCR反响条件：94℃ 6 min，56℃ 1 min，72℃10 min，共30个循环。制造2%琼脂糖凝胶，汲取PCR产品5 μL，凝胶成像体系中摄影，判读成果。
1.3 流式细胞术
免疫表型符号单克隆抗体CD7、CD117、CD33、CD34、CD38、cyMPO、CD13、CD36、CD56、CD11b、CD19、 CD16、CD14、CD64、CD25、CD122、CD132等试剂均为美国BD公司产品。①膜抗原检测：各色荧光单克隆抗体参加流式管中，参加上述EDTA抗凝骨髓液500 μL。室温孵育20 min，加150 μL溶血素充沛混匀，静置，待溶液透亮无絮状沉积，加PBS 1 mL 1000 rpm离心5 min，弃上清。加500 μL PBS后上机检测。②胞浆抗原检测：500 μL骨髓液与100 μL固定液孵育20 min，加PBS 1 mL1000 rpm离心5 min，弃上清，加100 μL破膜剂混匀静置调查溶液透亮后，加PBS 1 mL 1000 rpm离心5 min，弃上清，加调配好的各色单克隆抗体，常温、避光孵育20 min，加PBS 1 mL1000 rpm离心5 min，弃上清，加500 μL PBS上流式细胞仪检测。③单克隆抗体表达大于同型对照的20%为阳性。
1.4 统计学剖析
选用SPSS软件16.0进行统计学剖析，描绘偏态散布材料为中位数（Median），描绘正态散布材料为均数±规范差（x±s）。Wilcoxon rank sum test进行两样本间假设查验，选用Fisher准确概率法进行两样本率的比较，P<0.05为差异有统计学含义。
2 成果
2.1 CD25在36例AML患者中的表达成果
表达CD25的骨髓原始细胞占总骨髓原始细胞百分比>20%共5例，全组CD25+表达率为13.89%（5/36）。CD25别离在AML-M2组表达率为12.5%（1/8）、AML-M4组为18.18%（2/11）、AML-M5组为20%（2/10），余组未检测到CD25表达。Fisher准确概率法查验，CD25+表达率在各组间差异均无统计学含义（P>0.05），见表1。
2.2 CD25与36例AML患者免疫表型的相关性
表达CD7、CD117、CD33、CD34、CD38、cyMPO、CD13、 CD36、CD56、CD11b、CD19、CD16、CD14、CD64、CD122、CD132单克隆抗体的骨髓原始细胞百分比在CD25+AML-M2组和CD25-AML-M2组间、CD25+AML-M4组和CD25-AML-M4组间、CD25+AML-M5组和CD25-AML-M5组间差异均无统计学含义（P>0.05），见表2。36例AML患者均无CD122、CD132表达。
2.3 CD25与FLT3-ITD基因骤变的相关性
PCR成果显现，FLT野生型条带只要一条，在310 pb邻近，当FLT呈现内部串联仿制时，会在正常条带上方呈现分子量大于FLT的条带（图1）。在36例AML患者中有7例随同FLT3-ITD骤变基因，FLT3-ITD的表达率为19.4%（7/36）。5例CD25+AML患者组中FLT3-ITD+者为3例，CD25+AML兼并FLT3-ITD+率为60%（3/5），CD25+AML组与CD25-AML组比较，FLT3-ITD+表达不同有统计学含义（P=0.044）。
3评论
急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML） 病因不清晰，医治以化学医治为主，70%～80%能够到达完全缓解，但大都患者常因疾病复发导致长时刻生计率仅30%～40%[3]。依据FAB将AML分为7种亚型，其间急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）是一种特别类型，PML/RARα交融基因是其特征性表达基因分子，经过三氧化二砷及维甲酸联合靶向诱导细胞分解医治，90%以上的患者能够获得治好。AML免疫表型以表达MPO、CD117、CD13、CD33、CD15、CD64常见，约50%～60%的AML患者能够检测出反常核型，不同反常核型对AML患者预后有各自不同影响。跟着分子遗传学技能的开展，发现了许多反常遗传分子，与白血病的发病和预后有深远的联络。AML兼并AML1/ETO和CBFβ/MYH11交融基因时，对化学医治灵敏，预后较好，此外在兼并有NPM1、CEBPα时预后也相对杰出。当呈现杂乱核型、单倍体核型、MLL重排、C-KIT、DNMT3A和FLT3-ITD时，对AML预后存在不良影响。
有研讨发现，CD25在BCR/ABL+急性B淋巴细胞白血病（B-cell acute lymphocytic leukemia，B-ALL）患者中呈高水平表达，在长时刻生计（overall survival，OS）剖析方面，确诊为B-ALL伴BCR/ABL交融基因阳性的患者中，兼并有CD25+患者的OS较CD25-患者中位OS显着缩短[4]。因而，CD25作为B-ALL判别预后的新生物学目标，提示不良预后。
本研讨对36例AML患者进行CD25抗体符号，运用流式细胞术检测抗体荧光，评论CD25与AML的相关性。成果显现，本组36例AML患者有5例表达CD25+，表达率为13.89%（5/36）。国外研讨在大样本量（657例）的AML中检测CD25+表达率为13%，并在不同的骨髓细胞形状学阶段，即AML-M0～M7间均有表达，各个亚型间CD25+的表达率无显着不同，而CD11b常表达于CD25+AML，其他髓系免疫表型，如CD33、CD117、CD13、CD15、CD64与CD25相关性均无统计学含义[5]。本试验搜集到2例AML-M1、8例AML-M2、4例AML-M3、11例AML-M4、10例AML-M5、1例AML-M7，在AML-M1组、AML-M3组、AML-M7组内未检测到CD25的表达，在AML-M2组、AML-M4组和AML-M5组检测到并剖析了CD25在各组间表达不同均无统计学含义，提示CD25表达与髓系白血病细胞的不同细胞形状学阻滞阶段无相关性；一起在各组内CD7、CD117、CD33、CD34、CD38、cyMPO、CD13、 CD36、CD56、CD19、CD16、CD14、CD64在CD25+和CD25-组间表达无统计学差异，阐明CD25与常见的髓系免疫表型分子无显着相关性，对AML的确诊含义较低。与国外研讨不同的是，本试验中CD11b在AML-M2组、AML-M4组和AML-M5组内的表达状况与CD25无显着相关性，差异无统计学含义，可能与本试验搜集病例数较少有关，不能清晰CD25在悉数AML中的表达状况，需求扩展样本量以证明CD11b及其他髓系免疫表型在CD25+AML中的表达状况。
有国外研讨提出，CD25+AML中76%的患者兼并FLT3-ITD骤变[6]。FLT的内部串联仿制（ITDs）则构成FLT-ITD骤变，翻译构成反常蛋白信号分子经过下流STAT5信号通路使细胞发作恶性增殖[6，7]。FLT3-ITD骤变在成人AML患者的发作率约为24%[8]。PCR检测本组AML患者中有7例FLT3-ITD+，FLT3-ITD+的表达率为19.4%（7/36）。CD25+AML组中FLT3-ITD+表达率为60%（3/5），FLT3-ITD+在CD25+AML组CD25-AML组的表达水平差异有统计学含义，提示CD25+AML患者兼并FLT3-ITD基因骤变率较高。AML兼并FLT3-ITD骤变时提示疾病预后不良[9]。有研讨显现，CD25+FLT3-ITD+AML患者中位无复发作计（relapse free survival，RFS）时刻为6个月，较CD25-FLT3-ITD+AML患者中位RFS时刻（38个月）显着缩短，而CD25+FLT3-ITD-和CD25-FLT3-ITD-AML患者的中位RFS时刻别离为28、47个月；在FLT3-ITD+AML患者的长时刻生计（overall survival，OS）剖析中，CD25+组的中位OS时刻为8个月，较CD25-组25个月的中位OS时刻显着缩短[10]。因而，AML患者兼并有FLT3-ITD和CD25表达时，疾病复发时刻和长时刻生计时刻均缩短，CD25是AML不良预后的潜在目标，但CD25对AML预后影响的独立性，仍需求进一步清晰。
尽管CD122、CD132在36例AML中未见表达，提示IL-2不能经过受体直接对髓系白血病细胞发挥生理效果，但IL-15能够经过与IL-2Rα有类似空间结构的IL-15Rα别离与IL-2Rβ、IL-2Rγ组成受体[11]，代替IL-2激活Jak-STAT、MAP激酶和磷酸酰肌醇-3-激酶途径，然后对细胞发挥增殖调节效果[12-14]。FLT3-ITD蛋白常经过STAT5信号通路使细胞发作恶性增殖[7]，然后诱发白血病。现在IL-2R的Jak-STAT信号传导途径与FLT3-ITD蛋白下流STAT5信号通路之间的联络没有清晰，需求深层次的基础性研讨来解说。在相关临床研讨中，已证明CD25对AML患者的预后存在潜在不良影响，因而清晰CD25与AML的相关性有必定临床含义。
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（收稿日期：2014-03-18）
尽管CD122、CD132在36例AML中未见表达，提示IL-2不能经过受体直接对髓系白血病细胞发挥生理效果，但IL-15能够经过与IL-2Rα有类似空间结构的IL-15Rα别离与IL-2Rβ、IL-2Rγ组成受体[11]，代替IL-2激活Jak-STAT、MAP激酶和磷酸酰肌醇-3-激酶途径，然后对细胞发挥增殖调节效果[12-14]。FLT3-ITD蛋白常经过STAT5信号通路使细胞发作恶性增殖[7]，然后诱发白血病。现在IL-2R的Jak-STAT信号传导途径与FLT3-ITD蛋白下流STAT5信号通路之间的联络没有清晰，需求深层次的基础性研讨来解说。在相关临床研讨中，已证明CD25对AML患者的预后存在潜在不良影响，因而清晰CD25与AML的相关性有必定临床含义。
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（收稿日期：2014-03-18）
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（收稿日期：2014-03-18）
