王宗太 马宁宁
[摘要]人血清白蛋白（HAS）在人血浆中的含量最为丰厚，是蛋白质的一种，在血浆总蛋白中所占约60%的比重，生理功用不只重要，而且较多，一起其也是制药工业中最为重要的一种原辅佐料。当时商场中出售的HSA大部分为提取与人血浆，可是血液的躲藏危险较大，这就使得基因重组人血清蛋白（rHSA）成为HSA的首选代替品。本文要点介绍了重组人血清白蛋白在工业出产上运用的研讨开展。
[要害词]重组白蛋白；细胞培育；药用辅料
[中图分类号] R977.6 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）07（a）-0011-04
The pharmaceutical application research progress of industrial production of Human serum albumin
WANG Zong-tai1，2 MA Ning-ning1
1.Shenyang Pharmaceat：cal University，Liaoning Province，Shenyang 110016，China；2.Biotechnology Branch of worth China Phanmacetice co，Lal，Hebei Province，Shijiazhoang 056215，China
[Abstract]Human serum albumin（HAS） is the most abundant in human plasma，is a protein，in the plasma total protein accounted for about 60% of the proportion of physiological function is not only important，but also more，but also the pharmaceutical industry The most important of a kind of raw auxiliary materials. Most of the HSA sold in the current market is extracted with human plasma，but the risk of blood is greater，which makes the recombinant human serum albumin（rHSA） a preferred alternative to HSA.The pharmaceutical application research progress of industrial production of rHSA were reviewed in this article.
[Key words]Recombinant albumin；Cell culture；Excipient
人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是人血浆中最丰厚的蛋白质，占血浆总蛋白的50%～60%[1]。HSA归于一种单链无糖基化蛋白质，组成为585个氨基酸，分子量是66.5 kD，等电点介于4.7～4.9。整个分子回旋扭转故意型，其三维结构如图1所示。
图1 人血清蛋白分子结构图
HAS具有广泛的临床运用和工业运用，国内首要出产厂家有成都蓉生、山东泰邦、华兰生物、四川远大蜀阳、山西康宝、上海生物制品研讨所、上海莱士等。2015年国内批签发HAS约323吨，自2012年起接连四年增加率保持在10%以上，且因为血浆的缺少，进口产品约占58.7%，国内商场供给一直处于严重状态。一起，HSA的商场价格相对较高，最高可达每克40元，进而导致我国各大医院的HSA储备量紧急的状况，国家也不得不拟定多种限制性较强的办法改进现状。这也直接导致了HSA的暗盘高价买卖等变形出售现象。人们生活水平的额进步导致血液资源益发严重，HSA的紧缺状况也没有杰出的改进，形势严峻。现阶段，临床及商场中很多运用的HSA的提取制备办法是低温乙醇法（Chon）与柱层析法[2-3]，被提取物为人类血浆。可是，人类血液中存在缓慢乙肝、艾滋病等感染性疾病因子的可能性较大，且即便经过纯化工艺也难以确保不会将病毒带入产品中；另一方面血液供给也有限，特别是近年来生物医藥快速展开，人血白蛋白作为工业原辅料的需求量越来越大，使正本临床缺少的白蛋白更是落井下石，因而，寻觅血液代替品火烧眉毛。
1 HAS的展开
1981年，Genentech公司的Lwan及别的几位职工初次对重组人血蛋白（rHSA）CDNA序列进行了专业性报导，而且第一次运用色氨酸（Trp）启动子。色氨酸引导源于质粒pBR322的TC一和AmP基因，其一起构造出全球首个rHSA表达载体Phsai，并取得了其在大肠埃希菌中的成功表达。30多年来，世界上许多实验室和公司都测验经过遗传工程开发rHSA，且现已取得了突破性开展，国内外研讨现状见表1。
华北制药经过十几年的技能研发，构建了安稳、高效排泄表达基因工程菌，具有菌种构建、发酵、纯化等完好的自主知识产权，其间，纯化工艺专利在十三个国家取得授权。2011年建成契合cGMP出产线，产业化才能6吨/年，发酵单位达10 g/L以上，产率20%以上。比较由血浆提取HSA，选用基因重组技能出产rHSA，有显着优势：①严厉依照生物制品规范，强壮的工艺安稳性，很好的批次均一性；②纯度操控规范高于药典对HSA规则，纯度高达99%以上；③热原优势更显着，内控规范远高于国家药典对血源性HSA的规则；④具有血源HSA一起的氨基酸组成，有相同的理化特性；⑤无任何动物来历成份，远离血源性病毒污染，rHSA更安全；⑥原辅料没有限制，产量能满意商场供给。现在国内仅有华北制药具有了产业化条件，可是rHSA的工业运用尚处于前期，商场还在逐渐培育，6吨/年产能还没有彻底开释，依照现在的技能指标，满产后的本钱比较HAS具有非常强的商场竞争力（图2）。
图2 工艺流程框图
华北制药研发的rHSA具有与血源白蛋白相同的结构、理化特性。近年来，有越来越多的关于rHSA非医治效果的运用研讨报导，如用于细胞培育促进剂、蛋白类药物安稳剂、药物和基因转运载体、化妆品增加剂等。
2作为培育基的重要组分促进细胞正常成长
rHSA在动物细胞及胚胎培育中的生理功用较多[4]，能够作为自在基铲除剂、重金属螯合剂、安稳剂、外表活性剂以及养分物进行运用。它还可与维生素或激素等药物相结合，进而进入动物细胞中，进步细胞的成长速度，消除毒素以及蛋白酶等物质，削减其对细胞成长的不良影响。
2.1支撑低密度CHO细胞成长
生命科学近年来展开敏捷，哺乳动物细胞在生命科学中发挥着重要效果。动物源血清养分丰厚，是细胞培育的杰出培育基，可是动物源血清具有潜在的危险，是监管的难题。为证明rHSA联合化学成分断定的培育基能够支撑低密度细胞的成长，Zhu等展开了细胞培育实验，成果标明在培育基中增加恰当份额的rHSA，能有用支撑低密度CHO细胞的成长[5]。
2.2对Vero、HKC细胞的促成长效果
在狂犬疫苗的出产过程中，无论是运用Vero细胞仍是HKC细胞培育，在基础培育基中增加恰当份额的HSA能够显着促进细胞成长，然后进步病毒表达。运用生物技能出产的rHSA与HSA具有相同的结构和理化特性，理论上应该对平等细胞的成长具有与HAS相同的促进效果。咱们展开了很多的比照实验：针对Vero细胞[6]、HKC细胞等细胞，运用的培育基别离含相同份额的HAS和rHSA。实验成果证明，rHSA与HAS相同对Vero、HKC细胞有促成长效果。
2.3 rHSA在低温储藏和细胞复苏方面的效果
生物制品出产过程中及细胞库中广泛运用冷冻技能进行种子细胞的保存。用rHSA以培育基组分的办法进行细胞冻存，其效果与胎牛血清的效果类似，比较市面上常见的冷冻剂，rHSA对细胞增加的保持以及存活效果更为抱负。经过用rHSA代替胎牛血清进行低温储藏和复苏的研讨[7]，标明rHSA运用于细胞低温储藏是可行的。
3作为辅料是蛋白或肽类药物的杰出安稳剂
在实践药物以及生物制品的出产工作中，为进步其安稳性需增加必定量的安稳剂。HSA作为安稳剂现被广泛运用于当时商场出售的生物制剂中，其用量介于0.1%～0.2%。其被用作安稳剂的原因包含：①rHSA的安稳性杰出，溶解性较为抱负；②rHSA能够阻断蛋白质对容器壁的吸附。因而，rHSA在疫苗等制品中的运用率较高。血源HSA具有被污染的危险，也会因为其结构差异、出产批次不安稳等原因呈现各种问题，因而，rHSA有望代替HSA作为药物安稳剂[8]。美国FDA将rHSA作为药用辅料现已收载入药典，默克公司运用rHSA为辅料的麻腮风三联疫苗现已取得美国FDA同意上市。
3.1抗氧化效果
rHSA具有必定的抗氧化效果，该效果的存在于其剖析结构之间联系密切。rHSA中存在的很多点位均具有杰出的抗氧化活性[9]。比方，rHSA中存在的自在半胱氨酸残基Cys-34是一种还原性巯基，对rHSA发挥抗氧化功用具有重要效果。rHSA中含有6个蛋氨酸残基，该物质上也有必定的巯基，对氧化效果具有高度敏感性，并在发作氧化效果后发生蛋氨酸亚砜残基。长链脂肪酸结合于rHSA中的Lys-351、Lys-475、Arg-117对脂肪酸有杰出的维护效果，可削减自在基对其的进犯。一起，rHSA的Lys-240与胆红素相结合后，会对脂质过氧化进行杰出按捺。
3.2增强药物的靶向性及安全性
增强药物的靶向性对药物有用性以及安全性的进步均有重要含义。HSA是抗肿瘤药物的首要载体，其具有载药量高、安稳性好、缓释靶向的特色[10]。2005年FDA同意APP公司的以HSA为载体的紫杉醇产品Abraxane上市， Abraxane具有胜过紫杉醇注射液的显着长处。rHSA也相同能够作为一种药物载体，经过不同的办法使药物的靶向性得到增强。一方面，药物能够制作成rHSA的纳米制剂，就能够削减药物的毒副效果，进步有用性。另一方面经过对rHSA加以润饰后，使其与靶蛋白结合配体以及药物相连接，促进药物完成靶向效果。
3.3药物传输体系中的载体
rHSA是人体血脑屏障运送载体，一起也转运非侵略性基因。一般来说，人体内的蛋白质以及肽类药物进入血脑屏障的难度很大，可是嵌合肽的运用则能够将上述两类药物转运至血脑屏障内。无法进行转运的肽类药物能够和血脑药物的运载体一起构成一种嵌合肽[11]，而现已被阳离子化的rHSA中存在的氨基酸基團能够与多种化合物相结合。其与血脑屏障内皮中存在的多糖蛋白复合物发生静电效果，而阳离子化白蛋白-β-内啡嵌合肽就会凭借介导细胞的转运效果进入大脑安排中。
3.4药物在体内半衰期被延伸
HSA具有增加被结合蛋白分子质量，维护被结合蛋白的效果，当其与多肽类药物或许蛋白质结合后，会使其在人体内的半衰期有显着延伸现象。糖尿病的临床医治中，胰岛素是常用药物之一，但因其生物半衰期相对较短，因而需求增加用药频率以确保效果。Dut-taroy等在研讨中，将单链人胰岛素基因以及HSA二者相交融，终究取得半衰期较长的胰岛素，削减了给药频率[12]。别的，有研讨中将马来酰亚胺衍生物与HSA相结合，进而取得半衰期较长的胰岛[13]。
4 rHSA的其他运用
4.1 rHSA突变体
临床中首要经过光线疗法对重生儿科黄疸疾病以及Ⅰ型Crigler-Najjar综合征予以医治，而光线疗法结合重组白蛋白后再运用可快速有用的下降血清中没有结合的胆红素水平。Crigler-Najjar综合征医治的过程中，最为要害的医治点在于保持胆红素浓度，一般在20.0 nmol/L左右。除此之外，还需求确保胆红素全体浓度不能超过HSA的全体结合水平[14-15]。当光线疗法与rHSA相结合运用时能够将胆红素进行溶解，使其成为无毒性异构体之一。有相关研讨成果显现，改异构体的构成及构成速度和与rHSA结合的胆红素构象、电子环境联系严密，因而发生的rHSA突变体能够在短时间内发生很多具有较强可溶性的胆红素光合物，其与野性HSA比较，在进步光线医治效果中价值更高[16]。一起，rHSA突变体能够作为一种体外解毒剂效果在白蛋白透析中。
4.2 rHSA运用于化妆品范畴中的剖析
因为rHSA的特性，其在化妆品范畴是被作为水溶性蛋白而运用的，是一种中性缓冲液，其生物兼容性非常杰出，其运用于人体皮肤外表时，会在上面掩盖一层具有维护效果的薄膜，对去除皱纹、细纹具有杰出的效果，一起还能够让运用者的皮肤变得愈加透亮嫩滑[17]。在化妆品范畴中，rHSA常以活性化合物被运用于各种化妆品中，相对来说，洗剂和霜剂中的rHSA含量较高，运用者经过洗剂和霜剂的运用来吸收rHSA，以此对肌肤进行调度。白蛋白纯化液对面部皮肤因老化而发生的鱼尾纹具有敏捷的消除成效。在美国的一家化妆品公司，NEW CENTURY申请了一项专利，其首要内容为在该公司旗下的面霜、番笕、洗发露等洗护产品中增加必定量的rHSA，使其在运用过程中能够吸附在运用者的皮肤以及头发外表，发挥其安排修正效果，快速修正运用者受损发质以及肌肤，一起rHSA作为活性成分具有削减过敏反响的效果[18]。例如，在洗发产品中增加适量的rHSA会减缓患者头皮发痒的感觉，消除头皮屑。而在国内专利中，一种具有保湿、防裂、改进皮肤粗糙暗沉的润肤霜中增加了甘草提取液、甘油成分以及rHSA后，使其上述成效得以最大发挥。
4.3在医疗器械方面的运用
rHSA与聚乙二醇（PEG）组成聚合物水凝胶现已成为医疗器械范畴里的新成员，当这两种成分结合时，快速的交联反响发生水凝胶基质，具有强固的黏附性，这项技能让外科医生针对患者的胸腔手术，肺部漏气症状等能够进行更有用的手术。现在国内外许多公司正尽力将此技能的运用渠道扩展到脊柱、普通外科和妇产科等临床范畴。国外Neomend公司运用诺维信出产的rHSA制作了运用于外科手术的密封胶ProGEL？誖LATINUM，已取得欧盟CE标识。自2010年4月起，该技能已在美国8000多病例中得到运用。
5展望
HSA是常用的临床药物，也广泛运用于生物药物的工业出产，可作为细胞培育基的重要组分、蛋白质类药物或肽类药物的安稳剂、药物传输体系中的载体等等。跟着现代DNA重组技能、大规模培育和纯化技能的展开，世界、国内都完成了rHSA大规模产业化，且研讨成果标明产品结构、性质与HAS无显着差异。rHSA作为临床用药、药用辅料、细胞培育基组分在国外都有广泛运用，国内的相关研讨也都取得了实质性的开展。rHSA代替HAS具有广泛的社会含义，也是生物技能展开的必然趋势。
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（收稿日期：2017-05-21 本文修改：崔建中）
