张桃艳++++++李德祥+++++柳刚++++关广聚
[摘要] 意图 评论阻断肾淋巴循环对大鼠肾脏细胞Bax、Bcl-2表达的影响及与大鼠肾脏功用的联系。 办法 选取雄性Wistar大鼠48只，将其随机分为模型组和对照组，各24只。各组大鼠别离于术后第1、7、14、28天各处死6只，留取肾安排标本提取安排蛋白、mRNA和制造白腊切片。运用Real-time PCR、Western blot和免疫安排化学检测Bax、Bcl-2在肾安排中的表达，并测定24 h尿蛋白和血肌酐水平。 成果 模型组大鼠的肾功用逐步减退，跟着术后时刻的延伸，肾功用危害逐步加剧。模型组大鼠的Bax表达显着强于对照组，免疫安排化学显现，Bax的表达首要在肾小管及肾间质，远端小管的表达特别显着，相反，模型组大鼠的Bcl-2的表达显着削弱。 定论 阻断肾淋巴循环可导致大鼠肾功用及肾小管间质的危害，并随时刻延伸而加剧，肾细胞凋亡与此密切相关，其间Bax/Bcl-2途径发挥了积极效果。
[关键词] 淋巴循环；尿蛋白；血肌酐；Bax/Bcl-2
[中图分类号] R692.6 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）11（a）-0004-05
世界肾病学会发布的最新威望数据标明，缓慢肾脏病在成人中的发作率约为10%，年纪越大发病率越高。在缓慢肾脏病的构成进程中，细胞凋亡在其间的效果越来越遭到我们的注目[1-2]。细胞凋亡又称程序性的细胞逝世，一直是国内外学者研讨的热门。研讨标明，凋亡能够导致肾脏细胞削减，导致肾脏功用妨碍。在某些肾脏疾病模型中，如IgA肾病、红斑狼疮性肾炎等，肾小球硬化、肾脏功用的危害与肾小球细胞的凋亡密切相关。别的，肾小管及肾间质细胞的凋亡也可导致肾囊肿和肾纤维化的发作[3]。有研讨标明，在5/6肾切除大鼠模型中，肾小球的硬化和肾小管萎缩、消失与肾小球内皮细胞的凋亡密不可分[4]。近年来发现，Bcl-2 宗族是在细胞凋亡中有重要效果的一类蛋白质，在细胞凋亡信号转导途径中发挥重要效果，而Bcl-2 和Bax 别离是此宗族中最有代表性的按捺凋亡和促进凋亡基因[5]。本课题在危害肾淋巴循环基础上研讨凋亡是否参加了其间的发病进程，Bax/Bcl-2在此进程中的表达又怎么？从而为临床上缓慢肾脏病的发作寻觅新的依据。1 材料与办法1.1 试验动物分组与模型制造雄性Wistar大鼠48只，体重180～200 g（山东大学试验动物中心供给）。一切大鼠依照随机准则分为两组：对照组和模型组各24只。对照组大鼠经3%水合氯醛（1 ml/100 g）腹腔麻醉，别离出肾脏后切除右肾，模型组大鼠在此基础上再结扎左肾淋巴管，办法参阅Wilcox等[6-7]，即在肾被膜下及肾本质内打针0.5 ml 2% Evans蓝，显现清楚淋巴管后在外科手术显微镜下用4号线结扎左肾肾门淋巴管，并结扎左肾上下极脂肪纤维安排以阻断被膜下淋巴循环。各组大鼠别离于术后第1、7、14、28天各处死6只。1.2 标本留取 一切大鼠于处死前1 d开端留取24 h尿液，以测尿蛋白。处死进程中心脏取血测血肌酐。肾脏安排通过充沛灌洗后，分为两部分，一部分用于免疫安排化学；另一部分用于Western blot和Real-time PCR。1.3 免疫安排化学检测肾脏安排经惯例脱蜡、水化，然后切片，用3% H2O2关闭，再经微波修正后滴加Ⅰ抗（Bax作业浓度为1∶50，Bcl-2作业浓度为1∶1000。 Biosciences Pharmingen USA），放于4 ℃冷藏过夜。参加Ⅱ抗山羊抗兔IgG抗体（购自武汉博士德生物公司）。经DAB显色、苏木素复染后，再按惯例办法脱水、封片等，最终置于显微镜下调查成果。一切试验均设阴性对照，以PBS替代Ⅰ抗。本试验中所用免疫安排化学试剂盒等购自北京中杉生物公司。1.4 Western blot检测进程依据安排总蛋白提取试剂盒（购自申能博彩公司）说明办法提取大鼠肾脏总蛋白，然后用BCA法测定安排蛋白浓度。通过灌胶、电泳、转膜、牛奶关闭等进程后，加Ⅰ抗（Ⅰ抗浓度Bax 1∶1000，Bcl-2 1∶1000，β-actin单抗1∶5000）4 ℃冷藏过夜。加Ⅱ抗（1∶2500），室温放置1 h。然后依据ECL试剂盒（购自 Santa Cruz公司）说明在胶片上曝光及定影等，最终测定各蛋白带的灰度值，一切意图蛋白带的灰度值与与β-actin的灰度值进行比较，其比值就是各意图蛋白表达的丰度。1.5 Real-time PCR的检测进程取肾安排50 mg左右，按Trizol试剂盒（Invitrogen公司）说明抽提mRNA。并回转录成cDNA（试剂盒TaKaRa公司）。选用ABI PRISM 7000 HT进行Real-time PCR。引物序列（TaKaRa公司规划，上海生物化工有限公司组成）见表1。荧光Real-time PCR采纳两步法PCR程序：首要95℃预变性10 s，然后进行PCR反响，95℃ 5 s、60℃ 31 s，通过40个循环。两组间的比较使用Folds=2-ΔΔCt公式[8]进行剖析。表1 引物序列1.6 统计学处理 数据选用SPSS 11.0软件进行统计剖析，计量材料用均数±标准差（x±s）标明，选用方差查验与单要素剖析，以P<0.05为差异有统计学含义。 2 成果2.1 两组大鼠术后第1、7、14、28 天尿蛋白、血肌酐水平的比较 模型组大鼠的尿蛋白于术后第7天即呈现显着改变（P<0.05），手术时刻越长，肾功用危害越显着。模型组术后第14、28天的尿蛋白水平与同组第7天比较，差异有统计学含义（P<0.05），与对照组比较，差异有统计学含义（P<0.01）。相同，血肌酐水平改变类似于尿蛋白，模型组大鼠的血肌酐水平在术后第7天开端呈现显着改变，与对照组比较，差异有统计学含义（P<0.05），手术时刻越长，肾功用危害越显着。模型组第14天的血肌酐水平与同组第7天比较，差异有统计学含义（P<0.05），与对照组比较，差异有统计学含义（P<0.01）（表2）。表2 两组大鼠术后第1、7、14、28 天尿蛋白、血肌酐水平的比较（x±s） 与同组第7天比较，*P<0.05；与对照组同时刻比较，#P <0.05，▲P<0.01 2.2 两组大鼠肾安排Bax、Bcl-2的表达（免疫安排化学）对照组大鼠肾安排Bax的表达十分弱小，而模型组大鼠肾安排的Bax表达十分显着，首要的表达部位在肾小管及肾间质，远端小管的表达特别激烈。Bcl-2表达正好相反，对照组大鼠有显着的Bcl-2表达，其首要部位也在肾小管和肾间质，模型组大鼠Bcl-2的表达却十分弱小（图1）。图1 两组大鼠肾安排Bax、Bcl-2蛋白的表达（免疫安排化学×200）2.3 两组大鼠肾安排Bax、Bcl-2蛋白表达的比较（Western blot）Western blot剖析更能说明Bax、Bcl-2蛋白在两组大鼠间的不同表达。阻断肾淋巴循环后，模型组大鼠Bax蛋白的表达量显着增加，这与免疫安排化学调查到的现象根本符合。在术后第14天，模型组大鼠Bax的蛋白量就到达顶峰（P<0.01），今后保持逐步增高现象，而凋亡按捺蛋白Bcl-2的表达从术后第1天就呈现下降趋势，Bax/Bcl-2比值显着增高。对照组 Bax的表达十分弱小，相反Bcl-2的表达显着，与模型组正好相反。在整个术后进程中，对照组Bax、Bcl-2的表达根本无显着改变（图2）。2.4 两组大鼠肾安排Bax、Bcl-2 mRNA表达的比较（Real-time PCR）Real-time PCR 从基因水平反映了两组大鼠Bax、Bcl-2的表达状况。试验显现，模型组大鼠Bax的 mRNA表达在一切时刻段均呈显着增高趋势，其间顶峰期在第7天，而Bcl-2 mRNA表达却呈显着下降（P<0.05），跟着术后时刻的延伸而呈稳步下降的趋势。模型组Bax/Bcl-2 mRNA比值于术后第14天到达顶峰（P<0.01），与对照组比较显着增高。相反，对照组不管是Bax仍是Bcl-2 ，此两者的表达根本无显着改变（图3）。3 评论不管健康或疾病状态下，淋巴循环都有其重要的效果，惋惜的是，它的功用至今仍未清楚说明，乃至被疏忽。淋巴循环将间质剩余水分带回血液，把抗原和免疫活性细胞带到炎症部位的淋巴结。传统观念以为淋巴体系仅仅被迫的履行这些功用，现在跟着淋巴分子机制进一步研讨开展，这种观念正遭到应战。近年来，器官功用妨碍与其淋巴循环的联系逐步成为研讨热门，但没有到达一致。有报导称，淋巴循环妨碍对安排影响甚微[9]，但也有研讨标明，阻断肾脏的淋巴循环能够导致肾脏硬化[10]。本试验就针对肾脏淋巴循环和肾脏功用的联系进行了再次探究与研讨。成果标明，当阻断大鼠的肾脏淋巴循环后，大鼠的肾脏功用随之呈现改变。模型组大鼠的尿蛋白及血肌酐水平跟着术后时刻的延伸而不断升高。本试验中免疫安排化学成果提示，阻断肾脏的淋巴循环，其影响最显着的是肾小管及肾间质，由此可见，淋巴循环妨碍对肾功用的影响是显着的，这就为临床上原因不明的缓慢肾脏病，特别缓慢肾小管及肾间质病变供给了新的确诊思路。本研讨成果提示，淋巴循环妨碍不光危害肾脏功用，而且在此基础上，有关于凋亡的相关基因Bax/Bcl-2的表达也呈现显着改变，这为评论肾脏危害机制供给了新的头绪。众所周知，Bax/Bcl-2在凋亡中的重要效果，其与凋亡的联系一直是近年来研讨的热门[11-12]。Bcl-2 宗族中Bax是促进凋亡的重要蛋白，与此相反，Bcl-2却是按捺细胞凋亡的蛋白，两者的效果正好相反，因而两者的比值改变往往决议凋亡的发作与否[13-15]。近年来的研讨标明，肾细胞的凋亡与Bax/Bcl-2的比值密切相关。进步凋亡促进因子Bax与凋亡按捺因子Bcl-2 的比值，对肾小管萎缩、肾纤维化样的凋亡进程有显着的促进效果[16]。本试验的研讨成果证明了这一点。Western blot从蛋白水平反映了模型组大鼠的Bax表达显着增加，特别在术后14 d就到达顶峰。Real-time PCR从基因水平反映了模型组大鼠的Bax表达加强，而且在一切时刻段均呈显着增高趋势，而与此构成显着比照的是，Bcl-2表达均成下降趋势。模型组大鼠的Bax/Bcl-2比值显着增高。阻断肾脏的淋巴循环能够引起肾功用减退，此成果与凋亡基因表达的失衡密切相关。由此能够揣度，肾脏细胞的凋亡是淋巴循环妨碍导致肾功用阑珊的重要原因之一。淋巴循环妨碍关于肾脏的危害可能不只限于此，本研讨仅提醒了Bax/Bcl-2途径的改变，那么在肾淋巴循环妨碍进程中，是否还存在其他病理机制，尚待进一步研讨、探究。[参阅文献][1] Kitamura H，Shimizu A，Masuda Y，et al.Apoptosis in glomerular endothelial cells during the development of glomerulosclerosis in the remnant kidney model[J].Exp Nephrol，1998，6（4）：328-336.[2] Zhang N，Cheng GY，Liu XZ，et al.Expression of Bcl-2 and NF-κB in brain tissue after acute renal ischemia-reperfusion in rats[J].Asian Pac J Trop Med，2014，7（5）：386-389. [3] 段惠军，史永宏，张艳玲，等.肾切除大鼠残肾细胞凋亡及凋亡相关基因的表达[J].中华物理医学与恢复杂志，2001，23（5）：309-311.[4] Nankivell BJ，Borrows RJ，Fung CL，et al.The natural history of chronic allograft nephropathy[J].N Engl J Med，2003， 349（24）：2326-2333.[5] Sabirzhanov B，Zhao Z，Stoica BA，et al.Downregulation of miR-23a and miR-27a following experimental traumatic brain injury induces neuronal cell death through activation of proapoptotic Bcl-2 proteins[J].J Neurosci，2014，34（30）：10055-10071. [6] Wilcox CS，Sterzel RB，Dunckel PT，et al.Renal interstitial pressure and sodium excretion during hilar lymphatic ligation[J].Am J Physiol，1984，247（2 Pt 2）：F344-F351.[7] Stolarczyk J，Carone FA.Effects of renal lymphatic occlusion and venous constriction on renal function[J].Am J Pathol，1975，78（2）： 285-296. [8] Kitamura H，Shimizu A，Masuda Y，et al.Apoptosis in glomerular endothelial cells during the development of glomerulosclerosis in the remnant kidney model[J].Exp Nephrol，1998，6（4）：328-336.[9] 孙旭海，郭延章，王秀中，等.损坏肾淋巴循环对犬自体移植肾安排学的影响[J].第四军医大学学报，2003，24（10）：958-959.[10] Mironov AA，Eremin GA，Vasilenko VA，et al.Changes in kidney tissue elements after ligation of the lymphatic vessels.Role of disorders of lymph outflow after kidney transplantation[J].Arkh Anat Gistol Embriol，1980，79（10）：80-89.[11] Zagorodna O，Martin SM，Rutkowski DT，et al.2-deoxyglucose-induced toxicity is regulated by Bcl-2 family members and is enhanced by antagonizing Bcl-2 in lymphoma cell lines[J].Oncogene，2012，31（22）：2738-2749.[12] Sun Y，Lin Y，Li H，et al.2，5-Hexanedione induces human ovarian granulosa cell apoptosis through BCL-2，BAX，and CASPASE-3 signaling pathways[J].Arch Toxicol，2012，86（2）：205-215.[13] Lalier L，Cartron PF，Juin P，et al.Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis[J].Apoptosis，2007， 12（5）：887-896.[14] Gill MB，Perez-Polo JR.Bax shuttling after rotenone treatment of neuronal primary cultures：effects on cell death phenotypes[J].J Neurosci Res，2009，87（9）：2047-2065. [15] Lee do Y，Lee KS，Lee HJ，et al.Kynurenic acid attenuates MPP（+）-induced dopaminergic neuronal cell death via a Bax-mediated mitochondrial pathway[J].Eur J Cell Biol，2008，87（6）：389-397.[16] Rossé T，Olivier R， Monney L，et al.Bcl-2 prolongs cell survival after Bax-induced release of cytochrome c[J].Nature，1998，391（6666）： 496-499.（收稿日期：2014-08-26 本文修改：许俊琴）
[摘要] 意图 评论阻断肾淋巴循环对大鼠肾脏细胞Bax、Bcl-2表达的影响及与大鼠肾脏功用的联系。 办法 选取雄性Wistar大鼠48只，将其随机分为模型组和对照组，各24只。各组大鼠别离于术后第1、7、14、28天各处死6只，留取肾安排标本提取安排蛋白、mRNA和制造白腊切片。运用Real-time PCR、Western blot和免疫安排化学检测Bax、Bcl-2在肾安排中的表达，并测定24 h尿蛋白和血肌酐水平。 成果 模型组大鼠的肾功用逐步减退，跟着术后时刻的延伸，肾功用危害逐步加剧。模型组大鼠的Bax表达显着强于对照组，免疫安排化学显现，Bax的表达首要在肾小管及肾间质，远端小管的表达特别显着，相反，模型组大鼠的Bcl-2的表达显着削弱。 定论 阻断肾淋巴循环可导致大鼠肾功用及肾小管间质的危害，并随时刻延伸而加剧，肾细胞凋亡与此密切相关，其间Bax/Bcl-2途径发挥了积极效果。
[关键词] 淋巴循环；尿蛋白；血肌酐；Bax/Bcl-2
[中图分类号] R692.6 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）11（a）-0004-05
世界肾病学会发布的最新威望数据标明，缓慢肾脏病在成人中的发作率约为10%，年纪越大发病率越高。在缓慢肾脏病的构成进程中，细胞凋亡在其间的效果越来越遭到我们的注目[1-2]。细胞凋亡又称程序性的细胞逝世，一直是国内外学者研讨的热门。研讨标明，凋亡能够导致肾脏细胞削减，导致肾脏功用妨碍。在某些肾脏疾病模型中，如IgA肾病、红斑狼疮性肾炎等，肾小球硬化、肾脏功用的危害与肾小球细胞的凋亡密切相关。别的，肾小管及肾间质细胞的凋亡也可导致肾囊肿和肾纤维化的发作[3]。有研讨标明，在5/6肾切除大鼠模型中，肾小球的硬化和肾小管萎缩、消失与肾小球内皮细胞的凋亡密不可分[4]。近年来发现，Bcl-2 宗族是在细胞凋亡中有重要效果的一类蛋白质，在细胞凋亡信号转导途径中发挥重要效果，而Bcl-2 和Bax 别离是此宗族中最有代表性的按捺凋亡和促进凋亡基因[5]。本课题在危害肾淋巴循环基础上研讨凋亡是否参加了其间的发病进程，Bax/Bcl-2在此进程中的表达又怎么？从而为临床上缓慢肾脏病的发作寻觅新的依据。1 材料与办法1.1 试验动物分组与模型制造雄性Wistar大鼠48只，体重180～200 g（山东大学试验动物中心供给）。一切大鼠依照随机准则分为两组：对照组和模型组各24只。对照组大鼠经3%水合氯醛（1 ml/100 g）腹腔麻醉，别离出肾脏后切除右肾，模型组大鼠在此基础上再结扎左肾淋巴管，办法参阅Wilcox等[6-7]，即在肾被膜下及肾本质内打针0.5 ml 2% Evans蓝，显现清楚淋巴管后在外科手术显微镜下用4号线结扎左肾肾门淋巴管，并结扎左肾上下极脂肪纤维安排以阻断被膜下淋巴循环。各组大鼠别离于术后第1、7、14、28天各处死6只。1.2 标本留取 一切大鼠于处死前1 d开端留取24 h尿液，以测尿蛋白。处死进程中心脏取血测血肌酐。肾脏安排通过充沛灌洗后，分为两部分，一部分用于免疫安排化学；另一部分用于Western blot和Real-time PCR。1.3 免疫安排化学检测肾脏安排经惯例脱蜡、水化，然后切片，用3% H2O2关闭，再经微波修正后滴加Ⅰ抗（Bax作业浓度为1∶50，Bcl-2作业浓度为1∶1000。 Biosciences Pharmingen USA），放于4 ℃冷藏过夜。参加Ⅱ抗山羊抗兔IgG抗体（购自武汉博士德生物公司）。经DAB显色、苏木素复染后，再按惯例办法脱水、封片等，最终置于显微镜下调查成果。一切试验均设阴性对照，以PBS替代Ⅰ抗。本试验中所用免疫安排化学试剂盒等购自北京中杉生物公司。1.4 Western blot检测进程依据安排总蛋白提取试剂盒（购自申能博彩公司）说明办法提取大鼠肾脏总蛋白，然后用BCA法测定安排蛋白浓度。通过灌胶、电泳、转膜、牛奶关闭等进程后，加Ⅰ抗（Ⅰ抗浓度Bax 1∶1000，Bcl-2 1∶1000，β-actin单抗1∶5000）4 ℃冷藏过夜。加Ⅱ抗（1∶2500），室温放置1 h。然后依据ECL试剂盒（购自 Santa Cruz公司）说明在胶片上曝光及定影等，最终测定各蛋白带的灰度值，一切意图蛋白带的灰度值与与β-actin的灰度值进行比较，其比值就是各意图蛋白表达的丰度。1.5 Real-time PCR的检测进程取肾安排50 mg左右，按Trizol试剂盒（Invitrogen公司）说明抽提mRNA。并回转录成cDNA（试剂盒TaKaRa公司）。选用ABI PRISM 7000 HT进行Real-time PCR。引物序列（TaKaRa公司规划，上海生物化工有限公司组成）见表1。荧光Real-time PCR采纳两步法PCR程序：首要95℃预变性10 s，然后进行PCR反响，95℃ 5 s、60℃ 31 s，通过40个循环。两组间的比较使用Folds=2-ΔΔCt公式[8]进行剖析。表1 引物序列1.6 统计学处理 数据选用SPSS 11.0软件进行统计剖析，计量材料用均数±标准差（x±s）标明，选用方差查验与单要素剖析，以P<0.05为差异有统计学含义。 2 成果2.1 两组大鼠术后第1、7、14、28 天尿蛋白、血肌酐水平的比较 模型组大鼠的尿蛋白于术后第7天即呈现显着改变（P<0.05），手术时刻越长，肾功用危害越显着。模型组术后第14、28天的尿蛋白水平与同组第7天比较，差异有统计学含义（P<0.05），与对照组比较，差异有统计学含义（P<0.01）。相同，血肌酐水平改变类似于尿蛋白，模型组大鼠的血肌酐水平在术后第7天开端呈现显着改变，与对照组比较，差异有统计学含义（P<0.05），手术时刻越长，肾功用危害越显着。模型组第14天的血肌酐水平与同组第7天比较，差异有统计学含义（P<0.05），与对照组比较，差异有统计学含义（P<0.01）（表2）。表2 两组大鼠术后第1、7、14、28 天尿蛋白、血肌酐水平的比较（x±s） 与同组第7天比较，*P<0.05；与对照组同时刻比较，#P <0.05，▲P<0.01 2.2 两组大鼠肾安排Bax、Bcl-2的表达（免疫安排化学）对照组大鼠肾安排Bax的表达十分弱小，而模型组大鼠肾安排的Bax表达十分显着，首要的表达部位在肾小管及肾间质，远端小管的表达特别激烈。Bcl-2表达正好相反，对照组大鼠有显着的Bcl-2表达，其首要部位也在肾小管和肾间质，模型组大鼠Bcl-2的表达却十分弱小（图1）。图1 两组大鼠肾安排Bax、Bcl-2蛋白的表达（免疫安排化学×200）2.3 两组大鼠肾安排Bax、Bcl-2蛋白表达的比较（Western blot）Western blot剖析更能说明Bax、Bcl-2蛋白在两组大鼠间的不同表达。阻断肾淋巴循环后，模型组大鼠Bax蛋白的表达量显着增加，这与免疫安排化学调查到的现象根本符合。在术后第14天，模型组大鼠Bax的蛋白量就到达顶峰（P<0.01），今后保持逐步增高现象，而凋亡按捺蛋白Bcl-2的表达从术后第1天就呈现下降趋势，Bax/Bcl-2比值显着增高。对照组 Bax的表达十分弱小，相反Bcl-2的表达显着，与模型组正好相反。在整个术后进程中，对照组Bax、Bcl-2的表达根本无显着改变（图2）。2.4 两组大鼠肾安排Bax、Bcl-2 mRNA表达的比较（Real-time PCR）Real-time PCR 从基因水平反映了两组大鼠Bax、Bcl-2的表达状况。试验显现，模型组大鼠Bax的 mRNA表达在一切时刻段均呈显着增高趋势，其间顶峰期在第7天，而Bcl-2 mRNA表达却呈显着下降（P<0.05），跟着术后时刻的延伸而呈稳步下降的趋势。模型组Bax/Bcl-2 mRNA比值于术后第14天到达顶峰（P<0.01），与对照组比较显着增高。相反，对照组不管是Bax仍是Bcl-2 ，此两者的表达根本无显着改变（图3）。3 评论不管健康或疾病状态下，淋巴循环都有其重要的效果，惋惜的是，它的功用至今仍未清楚说明，乃至被疏忽。淋巴循环将间质剩余水分带回血液，把抗原和免疫活性细胞带到炎症部位的淋巴结。传统观念以为淋巴体系仅仅被迫的履行这些功用，现在跟着淋巴分子机制进一步研讨开展，这种观念正遭到应战。近年来，器官功用妨碍与其淋巴循环的联系逐步成为研讨热门，但没有到达一致。有报导称，淋巴循环妨碍对安排影响甚微[9]，但也有研讨标明，阻断肾脏的淋巴循环能够导致肾脏硬化[10]。本试验就针对肾脏淋巴循环和肾脏功用的联系进行了再次探究与研讨。成果标明，当阻断大鼠的肾脏淋巴循环后，大鼠的肾脏功用随之呈现改变。模型组大鼠的尿蛋白及血肌酐水平跟着术后时刻的延伸而不断升高。本试验中免疫安排化学成果提示，阻断肾脏的淋巴循环，其影响最显着的是肾小管及肾间质，由此可见，淋巴循环妨碍对肾功用的影响是显着的，这就为临床上原因不明的缓慢肾脏病，特别缓慢肾小管及肾间质病变供给了新的确诊思路。本研讨成果提示，淋巴循环妨碍不光危害肾脏功用，而且在此基础上，有关于凋亡的相关基因Bax/Bcl-2的表达也呈现显着改变，这为评论肾脏危害机制供给了新的头绪。众所周知，Bax/Bcl-2在凋亡中的重要效果，其与凋亡的联系一直是近年来研讨的热门[11-12]。Bcl-2 宗族中Bax是促进凋亡的重要蛋白，与此相反，Bcl-2却是按捺细胞凋亡的蛋白，两者的效果正好相反，因而两者的比值改变往往决议凋亡的发作与否[13-15]。近年来的研讨标明，肾细胞的凋亡与Bax/Bcl-2的比值密切相关。进步凋亡促进因子Bax与凋亡按捺因子Bcl-2 的比值，对肾小管萎缩、肾纤维化样的凋亡进程有显着的促进效果[16]。本试验的研讨成果证明了这一点。Western blot从蛋白水平反映了模型组大鼠的Bax表达显着增加，特别在术后14 d就到达顶峰。Real-time PCR从基因水平反映了模型组大鼠的Bax表达加强，而且在一切时刻段均呈显着增高趋势，而与此构成显着比照的是，Bcl-2表达均成下降趋势。模型组大鼠的Bax/Bcl-2比值显着增高。阻断肾脏的淋巴循环能够引起肾功用减退，此成果与凋亡基因表达的失衡密切相关。由此能够揣度，肾脏细胞的凋亡是淋巴循环妨碍导致肾功用阑珊的重要原因之一。淋巴循环妨碍关于肾脏的危害可能不只限于此，本研讨仅提醒了Bax/Bcl-2途径的改变，那么在肾淋巴循环妨碍进程中，是否还存在其他病理机制，尚待进一步研讨、探究。[参阅文献][1] Kitamura H，Shimizu A，Masuda Y，et al.Apoptosis in glomerular endothelial cells during the development of glomerulosclerosis in the remnant kidney model[J].Exp Nephrol，1998，6（4）：328-336.[2] Zhang N，Cheng GY，Liu XZ，et al.Expression of Bcl-2 and NF-κB in brain tissue after acute renal ischemia-reperfusion in rats[J].Asian Pac J Trop Med，2014，7（5）：386-389. [3] 段惠军，史永宏，张艳玲，等.肾切除大鼠残肾细胞凋亡及凋亡相关基因的表达[J].中华物理医学与恢复杂志，2001，23（5）：309-311.[4] Nankivell BJ，Borrows RJ，Fung CL，et al.The natural history of chronic allograft nephropathy[J].N Engl J Med，2003， 349（24）：2326-2333.[5] Sabirzhanov B，Zhao Z，Stoica BA，et al.Downregulation of miR-23a and miR-27a following experimental traumatic brain injury induces neuronal cell death through activation of proapoptotic Bcl-2 proteins[J].J Neurosci，2014，34（30）：10055-10071. [6] Wilcox CS，Sterzel RB，Dunckel PT，et al.Renal interstitial pressure and sodium excretion during hilar lymphatic ligation[J].Am J Physiol，1984，247（2 Pt 2）：F344-F351.[7] Stolarczyk J，Carone FA.Effects of renal lymphatic occlusion and venous constriction on renal function[J].Am J Pathol，1975，78（2）： 285-296. [8] Kitamura H，Shimizu A，Masuda Y，et al.Apoptosis in glomerular endothelial cells during the development of glomerulosclerosis in the remnant kidney model[J].Exp Nephrol，1998，6（4）：328-336.[9] 孙旭海，郭延章，王秀中，等.损坏肾淋巴循环对犬自体移植肾安排学的影响[J].第四军医大学学报，2003，24（10）：958-959.[10] Mironov AA，Eremin GA，Vasilenko VA，et al.Changes in kidney tissue elements after ligation of the lymphatic vessels.Role of disorders of lymph outflow after kidney transplantation[J].Arkh Anat Gistol Embriol，1980，79（10）：80-89.[11] Zagorodna O，Martin SM，Rutkowski DT，et al.2-deoxyglucose-induced toxicity is regulated by Bcl-2 family members and is enhanced by antagonizing Bcl-2 in lymphoma cell lines[J].Oncogene，2012，31（22）：2738-2749.[12] Sun Y，Lin Y，Li H，et al.2，5-Hexanedione induces human ovarian granulosa cell apoptosis through BCL-2，BAX，and CASPASE-3 signaling pathways[J].Arch Toxicol，2012，86（2）：205-215.[13] Lalier L，Cartron PF，Juin P，et al.Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis[J].Apoptosis，2007， 12（5）：887-896.[14] Gill MB，Perez-Polo JR.Bax shuttling after rotenone treatment of neuronal primary cultures：effects on cell death phenotypes[J].J Neurosci Res，2009，87（9）：2047-2065. [15] Lee do Y，Lee KS，Lee HJ，et al.Kynurenic acid attenuates MPP（+）-induced dopaminergic neuronal cell death via a Bax-mediated mitochondrial pathway[J].Eur J Cell Biol，2008，87（6）：389-397.[16] Rossé T，Olivier R， Monney L，et al.Bcl-2 prolongs cell survival after Bax-induced release of cytochrome c[J].Nature，1998，391（6666）： 496-499.（收稿日期：2014-08-26 本文修改：许俊琴）
[摘要] 意图 评论阻断肾淋巴循环对大鼠肾脏细胞Bax、Bcl-2表达的影响及与大鼠肾脏功用的联系。 办法 选取雄性Wistar大鼠48只，将其随机分为模型组和对照组，各24只。各组大鼠别离于术后第1、7、14、28天各处死6只，留取肾安排标本提取安排蛋白、mRNA和制造白腊切片。运用Real-time PCR、Western blot和免疫安排化学检测Bax、Bcl-2在肾安排中的表达，并测定24 h尿蛋白和血肌酐水平。 成果 模型组大鼠的肾功用逐步减退，跟着术后时刻的延伸，肾功用危害逐步加剧。模型组大鼠的Bax表达显着强于对照组，免疫安排化学显现，Bax的表达首要在肾小管及肾间质，远端小管的表达特别显着，相反，模型组大鼠的Bcl-2的表达显着削弱。 定论 阻断肾淋巴循环可导致大鼠肾功用及肾小管间质的危害，并随时刻延伸而加剧，肾细胞凋亡与此密切相关，其间Bax/Bcl-2途径发挥了积极效果。
[关键词] 淋巴循环；尿蛋白；血肌酐；Bax/Bcl-2
[中图分类号] R692.6 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）11（a）-0004-05
世界肾病学会发布的最新威望数据标明，缓慢肾脏病在成人中的发作率约为10%，年纪越大发病率越高。在缓慢肾脏病的构成进程中，细胞凋亡在其间的效果越来越遭到我们的注目[1-2]。细胞凋亡又称程序性的细胞逝世，一直是国内外学者研讨的热门。研讨标明，凋亡能够导致肾脏细胞削减，导致肾脏功用妨碍。在某些肾脏疾病模型中，如IgA肾病、红斑狼疮性肾炎等，肾小球硬化、肾脏功用的危害与肾小球细胞的凋亡密切相关。别的，肾小管及肾间质细胞的凋亡也可导致肾囊肿和肾纤维化的发作[3]。有研讨标明，在5/6肾切除大鼠模型中，肾小球的硬化和肾小管萎缩、消失与肾小球内皮细胞的凋亡密不可分[4]。近年来发现，Bcl-2 宗族是在细胞凋亡中有重要效果的一类蛋白质，在细胞凋亡信号转导途径中发挥重要效果，而Bcl-2 和Bax 别离是此宗族中最有代表性的按捺凋亡和促进凋亡基因[5]。本课题在危害肾淋巴循环基础上研讨凋亡是否参加了其间的发病进程，Bax/Bcl-2在此进程中的表达又怎么？从而为临床上缓慢肾脏病的发作寻觅新的依据。1 材料与办法1.1 试验动物分组与模型制造雄性Wistar大鼠48只，体重180～200 g（山东大学试验动物中心供给）。一切大鼠依照随机准则分为两组：对照组和模型组各24只。对照组大鼠经3%水合氯醛（1 ml/100 g）腹腔麻醉，别离出肾脏后切除右肾，模型组大鼠在此基础上再结扎左肾淋巴管，办法参阅Wilcox等[6-7]，即在肾被膜下及肾本质内打针0.5 ml 2% Evans蓝，显现清楚淋巴管后在外科手术显微镜下用4号线结扎左肾肾门淋巴管，并结扎左肾上下极脂肪纤维安排以阻断被膜下淋巴循环。各组大鼠别离于术后第1、7、14、28天各处死6只。1.2 标本留取 一切大鼠于处死前1 d开端留取24 h尿液，以测尿蛋白。处死进程中心脏取血测血肌酐。肾脏安排通过充沛灌洗后，分为两部分，一部分用于免疫安排化学；另一部分用于Western blot和Real-time PCR。1.3 免疫安排化学检测肾脏安排经惯例脱蜡、水化，然后切片，用3% H2O2关闭，再经微波修正后滴加Ⅰ抗（Bax作业浓度为1∶50，Bcl-2作业浓度为1∶1000。 Biosciences Pharmingen USA），放于4 ℃冷藏过夜。参加Ⅱ抗山羊抗兔IgG抗体（购自武汉博士德生物公司）。经DAB显色、苏木素复染后，再按惯例办法脱水、封片等，最终置于显微镜下调查成果。一切试验均设阴性对照，以PBS替代Ⅰ抗。本试验中所用免疫安排化学试剂盒等购自北京中杉生物公司。1.4 Western blot检测进程依据安排总蛋白提取试剂盒（购自申能博彩公司）说明办法提取大鼠肾脏总蛋白，然后用BCA法测定安排蛋白浓度。通过灌胶、电泳、转膜、牛奶关闭等进程后，加Ⅰ抗（Ⅰ抗浓度Bax 1∶1000，Bcl-2 1∶1000，β-actin单抗1∶5000）4 ℃冷藏过夜。加Ⅱ抗（1∶2500），室温放置1 h。然后依据ECL试剂盒（购自 Santa Cruz公司）说明在胶片上曝光及定影等，最终测定各蛋白带的灰度值，一切意图蛋白带的灰度值与与β-actin的灰度值进行比较，其比值就是各意图蛋白表达的丰度。1.5 Real-time PCR的检测进程取肾安排50 mg左右，按Trizol试剂盒（Invitrogen公司）说明抽提mRNA。并回转录成cDNA（试剂盒TaKaRa公司）。选用ABI PRISM 7000 HT进行Real-time PCR。引物序列（TaKaRa公司规划，上海生物化工有限公司组成）见表1。荧光Real-time PCR采纳两步法PCR程序：首要95℃预变性10 s，然后进行PCR反响，95℃ 5 s、60℃ 31 s，通过40个循环。两组间的比较使用Folds=2-ΔΔCt公式[8]进行剖析。表1 引物序列1.6 统计学处理 数据选用SPSS 11.0软件进行统计剖析，计量材料用均数±标准差（x±s）标明，选用方差查验与单要素剖析，以P<0.05为差异有统计学含义。 2 成果2.1 两组大鼠术后第1、7、14、28 天尿蛋白、血肌酐水平的比较 模型组大鼠的尿蛋白于术后第7天即呈现显着改变（P<0.05），手术时刻越长，肾功用危害越显着。模型组术后第14、28天的尿蛋白水平与同组第7天比较，差异有统计学含义（P<0.05），与对照组比较，差异有统计学含义（P<0.01）。相同，血肌酐水平改变类似于尿蛋白，模型组大鼠的血肌酐水平在术后第7天开端呈现显着改变，与对照组比较，差异有统计学含义（P<0.05），手术时刻越长，肾功用危害越显着。模型组第14天的血肌酐水平与同组第7天比较，差异有统计学含义（P<0.05），与对照组比较，差异有统计学含义（P<0.01）（表2）。表2 两组大鼠术后第1、7、14、28 天尿蛋白、血肌酐水平的比较（x±s） 与同组第7天比较，*P<0.05；与对照组同时刻比较，#P <0.05，▲P<0.01 2.2 两组大鼠肾安排Bax、Bcl-2的表达（免疫安排化学）对照组大鼠肾安排Bax的表达十分弱小，而模型组大鼠肾安排的Bax表达十分显着，首要的表达部位在肾小管及肾间质，远端小管的表达特别激烈。Bcl-2表达正好相反，对照组大鼠有显着的Bcl-2表达，其首要部位也在肾小管和肾间质，模型组大鼠Bcl-2的表达却十分弱小（图1）。图1 两组大鼠肾安排Bax、Bcl-2蛋白的表达（免疫安排化学×200）2.3 两组大鼠肾安排Bax、Bcl-2蛋白表达的比较（Western blot）Western blot剖析更能说明Bax、Bcl-2蛋白在两组大鼠间的不同表达。阻断肾淋巴循环后，模型组大鼠Bax蛋白的表达量显着增加，这与免疫安排化学调查到的现象根本符合。在术后第14天，模型组大鼠Bax的蛋白量就到达顶峰（P<0.01），今后保持逐步增高现象，而凋亡按捺蛋白Bcl-2的表达从术后第1天就呈现下降趋势，Bax/Bcl-2比值显着增高。对照组 Bax的表达十分弱小，相反Bcl-2的表达显着，与模型组正好相反。在整个术后进程中，对照组Bax、Bcl-2的表达根本无显着改变（图2）。2.4 两组大鼠肾安排Bax、Bcl-2 mRNA表达的比较（Real-time PCR）Real-time PCR 从基因水平反映了两组大鼠Bax、Bcl-2的表达状况。试验显现，模型组大鼠Bax的 mRNA表达在一切时刻段均呈显着增高趋势，其间顶峰期在第7天，而Bcl-2 mRNA表达却呈显着下降（P<0.05），跟着术后时刻的延伸而呈稳步下降的趋势。模型组Bax/Bcl-2 mRNA比值于术后第14天到达顶峰（P<0.01），与对照组比较显着增高。相反，对照组不管是Bax仍是Bcl-2 ，此两者的表达根本无显着改变（图3）。3 评论不管健康或疾病状态下，淋巴循环都有其重要的效果，惋惜的是，它的功用至今仍未清楚说明，乃至被疏忽。淋巴循环将间质剩余水分带回血液，把抗原和免疫活性细胞带到炎症部位的淋巴结。传统观念以为淋巴体系仅仅被迫的履行这些功用，现在跟着淋巴分子机制进一步研讨开展，这种观念正遭到应战。近年来，器官功用妨碍与其淋巴循环的联系逐步成为研讨热门，但没有到达一致。有报导称，淋巴循环妨碍对安排影响甚微[9]，但也有研讨标明，阻断肾脏的淋巴循环能够导致肾脏硬化[10]。本试验就针对肾脏淋巴循环和肾脏功用的联系进行了再次探究与研讨。成果标明，当阻断大鼠的肾脏淋巴循环后，大鼠的肾脏功用随之呈现改变。模型组大鼠的尿蛋白及血肌酐水平跟着术后时刻的延伸而不断升高。本试验中免疫安排化学成果提示，阻断肾脏的淋巴循环，其影响最显着的是肾小管及肾间质，由此可见，淋巴循环妨碍对肾功用的影响是显着的，这就为临床上原因不明的缓慢肾脏病，特别缓慢肾小管及肾间质病变供给了新的确诊思路。本研讨成果提示，淋巴循环妨碍不光危害肾脏功用，而且在此基础上，有关于凋亡的相关基因Bax/Bcl-2的表达也呈现显着改变，这为评论肾脏危害机制供给了新的头绪。众所周知，Bax/Bcl-2在凋亡中的重要效果，其与凋亡的联系一直是近年来研讨的热门[11-12]。Bcl-2 宗族中Bax是促进凋亡的重要蛋白，与此相反，Bcl-2却是按捺细胞凋亡的蛋白，两者的效果正好相反，因而两者的比值改变往往决议凋亡的发作与否[13-15]。近年来的研讨标明，肾细胞的凋亡与Bax/Bcl-2的比值密切相关。进步凋亡促进因子Bax与凋亡按捺因子Bcl-2 的比值，对肾小管萎缩、肾纤维化样的凋亡进程有显着的促进效果[16]。本试验的研讨成果证明了这一点。Western blot从蛋白水平反映了模型组大鼠的Bax表达显着增加，特别在术后14 d就到达顶峰。Real-time PCR从基因水平反映了模型组大鼠的Bax表达加强，而且在一切时刻段均呈显着增高趋势，而与此构成显着比照的是，Bcl-2表达均成下降趋势。模型组大鼠的Bax/Bcl-2比值显着增高。阻断肾脏的淋巴循环能够引起肾功用减退，此成果与凋亡基因表达的失衡密切相关。由此能够揣度，肾脏细胞的凋亡是淋巴循环妨碍导致肾功用阑珊的重要原因之一。淋巴循环妨碍关于肾脏的危害可能不只限于此，本研讨仅提醒了Bax/Bcl-2途径的改变，那么在肾淋巴循环妨碍进程中，是否还存在其他病理机制，尚待进一步研讨、探究。[参阅文献][1] Kitamura H，Shimizu A，Masuda Y，et al.Apoptosis in glomerular endothelial cells during the development of glomerulosclerosis in the remnant kidney model[J].Exp Nephrol，1998，6（4）：328-336.[2] Zhang N，Cheng GY，Liu XZ，et al.Expression of Bcl-2 and NF-κB in brain tissue after acute renal ischemia-reperfusion in rats[J].Asian Pac J Trop Med，2014，7（5）：386-389. 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