冯明玉++韦平++倪琼秀++杨玲蓉
[摘要]意图 评论LncRNA BCYRN1在小儿哮喘患者血清中的表达及对小儿哮喘病况及预后的影响。办法 挑选2012年1月～2015年12月于我院随访的120例稳定时哮喘患儿（间歇发生30例、轻度继续发生30例、中度继续发生30例、重度继续发生30例）和30例健康对照儿童的血清样本，选用实时荧光定量PCR（QRT-PCR）检测血清中LncRNA BCYRN1与炎性因子TNF-α、IL-4、IgE的表达水平，剖析LncRNA BCYRN1的表达对患儿预后的影响及其与TNF-α、IL-4、IgE的表达的相关性。成果 LncRNA BCYRN1在哮喘患儿血清中的表达较健康对照儿童显着增高，LncRNA BCYRN1表达随转归加剧呈升高趋势，差异有统计学含义（P<0.05）。LncRNA BCYRN1随转归加剧呈升高趋势，差异有统计学含义（P<0.05）。LncRNA BCYRN1的表达与炎性因子TNF-α、IL-4、IgE的表达到正相关（r=0.712、0.770、0.748，均P<0.001）。定论 LncRNA BCYRN1表达水平与小儿哮喘病况严重程度有关，可作为判别预后的目标，对临床小儿哮喘预后的判别具有必定效果。
[关键词]小儿哮喘；LncRNA BCYRN1；预后
[中图分类号] R725.6 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）04（b）-0009-04
Expression and clinical significance of LncRNA BCYRN1 in serum of children with asthma
FENG Ming-yu1 WEI Ping1 NI Qiong-xiu1 YANG Ling-rong2▲
1.Department of Pediatrics，Shuangliu District Hospital of Traditional Chinese Medicine in Chengdu City，Sichuan Province，Chengdu 610200，China；2.Department of Pediatrics，the Third People′s Hospital of Sichuan，Chengdu 610000，China
[Abstract]Objective To investigate the expression of serum LncRNA BCYRN1 in children with asthma and the influence on the situation and prognosis.Methods Serum samples of 120 children with stable asthma from January 2012 to December 2015 in our hospital （including 30 cases of intermittent episodes，30 cases of mild sustained episodes，30 cases of moderate sustained episodes，30 cases of severe persistent episodes） and 30 cases of healthy children as health control were collected.The expression levels of LncRNA BCYRN1 and TNF-α，IL-4，IgE were detected by real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） and the effect of LncRNA BCYRN1 expression on the prognosis were also analyzed.Meanwhile，the relationship between serum LncRNABCYRN1 expression and inflammatory factors IgE，IL-4 and TNF-α were analyzed.Results The expression of LncRNA BCYRN1 in the serum of asthmatic children was significantly higher than that in the children of health control （P<0.05）.The expression level of LncRNA BCYRN1 increased gradually with the aggravation of the disease （P<0.05）.A positive correlation was also found between LncRNA BCYRN1 expression and inflammatory factors TNF-α，IL-4，IgE （r=0.712，0.770，0.748，all P<0.001）.Conclusion The expression of LncRNA BCYRN1 level associated with children asthma.LncRNA BCYRN1 can be as a predict biomarker of prognosis in children asthma.
[Key words]Children asthma；LncRNA BCYRN1；Prognosis
哮喘是兒童最为常见的缓慢炎症性疾病之一，首要以重复发生的气道梗阻、支气管高反响性、气道炎性细胞滋润为主，首要表现为重复发生性喘息、胸闷、咳嗽、胸部紧迫感和气促等症状[1-2]。近年来，小儿哮喘的发病率逐年添加。美国报导其小儿哮喘及喘息症状的发病率高达9.4%（约为7百万），每年哮喘相关的逝世达7000人[3]。香港13～14岁儿童哮喘发病率最高约为11.0%，北京地区高达10.7%，严重影响小儿的身心健康。其发病机制包含遗传要素及环境中的变应原等[4]。现在尽管关于小儿哮喘防治有一些有用的医治办法，但哮喘发病率仍然逐年升高，且哮喘发生的风险要素及其详细机制不清楚。近年来的研讨标明，非编码RNA（non-coding RNA，ncRNAs）在哮喘的发病进程中发挥着重要的效果[5]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，Lnc RNA）是长度在200个核苷酸以上的非编码RNA。近年来的研讨首要会集在LncRNA作为癌症的生物标志物，研讨发现LncRNA能够作为癌症的前期挑选、确诊、预后评价生物标志物[6-7]。但是关于LncRNA在哮喘中的研讨很少，LncRNA对这种不运用病理查验进行确诊的疾病，供给一种在体液中即可进行前期挑选的分子标志物将对哮喘疾病的确诊供给重要含义[8]。研讨报导，LncRNA BCYRN1作为microRNA海绵影响支气管平滑肌的功用[9]，但是关于LncRNA BCYRN1在哮喘患儿血清中的表达及与临床预后的联系现在国内外没有见相关报导。本研讨将进一步检测正常及哮喘患儿血清中LncRNA BCYRN1的表达，剖析其与哮喘前期确诊及临床预后评价的联系。
1目标与办法
1.1目标
挑选2012年1月～2015年12月于我院随访的120例稳定时哮喘患儿，其间男65例，女55例；平均年纪（8.3±3.7）岁；间歇发生30例[男性16例，女人14例，平均年纪（8.0±3.2）岁]，轻度继续发生30例[其间男性17例，女人13例，平均年纪（7.9±3.9）岁]，中度继续发生30例[男性18例，女人12例，平均年纪（8.0±4.0）岁]，重度继续发生30例[男性17例，女人13例，平均年纪（8.0±3.0）岁]。一起挑选30例健康儿童作为健康对照进行研讨，其间男17例，女13例，平均年纪（8.0±4）岁。哮喘患儿与对照组儿童之间性别构成、年纪差异均无统计学含义（P>0.05）。间歇、轻度继续发生、中度继续发生及重度继续发生组患儿年纪、性别构成比之间差异无统计学含义（P>0.05），具有可比性。各组患儿及健康对照儿童之间均无其他根底性疾病及合并症。搜集儿童血液标本进一步研讨。本研讨经我院医学道德委员会同意，一切患儿的宗族均签署了知情同意书。患儿其他状况无特别。转归及随访医治2年以上患儿无哮喘发生视为完全缓解。未完全缓解者依照哮喘操控规范[10-11]归类为好转、继续和加剧。选用电话及门诊复诊的办法进行随访，电话随访时刻为3个月1次，1年随访4次。随访期间120例哮喘患儿中完全缓解28例，好转42例，继续25例，加剧25例。归入规范：①确诊均契合中华医学会儿科学分会呼吸学组拟定的支气管哮喘防治惯例确诊规范[12]。②试验前2周内均未运用过茶碱、丙种球蛋白、糖皮质激素、色甘酸钠、白三稀拮抗剂等免疫调节药物。扫除规范：①伴有其他心肺疾病患者、患有本身免疫性疾病史、肿瘤等恶性病史的患儿予以扫除；②本身过敏及过敏性宗族史的患儿予以扫除。
1.2办法
1.2.1标本收集和处理 契合当选规范的患儿别离于首诊时或医治前24 h内及通过3～6个月的操控医治后患儿清晨空腹肘静脉血3～5 ml，4℃，3000 r/min，离心10 min，取上层血清。取到上层血清之后参加Trizol混匀后置于-80℃冰箱保存，以备提取RNA。
1.2.2选用雙抗夹心ELISA法测定炎性因子的表达 患儿均在入院的第2天清晨空腹抽静脉血3 ml，置于4℃冰箱内约30 min，血液凝聚后3000 r/min，离心15 min，别离血清，取血清，测定患儿的血清4℃水平，选用双抗夹心ELISA法测定TNF-α、IL-4、IgE的表达，详细测定过程均依照试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）供给的过程进行。
1.2.3实时荧光定量PCR剖析miRNAs的表达 依据Trizol试剂盒（Invitrogen公司，美国）提取总RNA，选用逆转录试剂盒（Takala，大连宝生生物）和实时荧光定量PCR试剂盒（Takala，大连宝生生物）进行逆转录和PCR扩增。逆转录反响参照AMV逆转录试剂盒阐明，在20 μl系统中加2 μg总RNA进行cDNA的组成。逆转录反响程序为：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 10 min。完毕后立行将cDNA产品取出，置于-20℃冰箱备用。Real-time PCR选用2×SYBR Green PCR Master Mix，取适量cDNA作为摸板，引物浓度0.4 μmol/L，15 μl系统进行扩增，每个待测样本设置3个平行样，PCR反响在ABI 7500实时定量PCR反响仪上进行，程序为（95℃，3 min）；40 cycles×（95℃ 12 s，62℃ 1 min）；95℃ 15 s。反响完毕后承认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制造规范曲线等。3次独立试验后得到的数据运用公式2-△△Ct进行剖析。
1.3统计学办法
选用SPSS 13.0统计学软件进行数据剖析，计量材料用均数±规范差（x±s）标明，多组间比较选用方差剖析，两组间比较选用t查验；非正态分布者组间比较选用Wilcoxon非参数秩和查验，多组间比较选用Kruskal-Wallis非参数查验；计数材料用率标明，组间比较选用χ2查验；相关性剖析选用Pearson相关剖析，以P<0.05为差异有统计学含义。
2成果
2.1 LncRNA BCYRN1在不同哮喘状况及健康对照儿童中的差异的表达
QRT-PCR检测LncRNA BCYRN1在不同哮喘状况患儿以及健康对照儿童血清中的表达，成果显现LncRNA BCYRN1在健康对照儿童中的表达为1.007±0.034，较哮喘患儿中的表达显着下降，LncRNA BCYRN1表达随转归加剧呈升高趋势，LncRNA BCYRN1在间歇发生期、轻度继续发生、中度继续发生及中度继续发生期的表达别离为3.750±0.200、5.450±0.450、8.230±0.034、14.890±0.770，与健康对照比较差异有统计学含义（P<0.01）（图1）。
2.2 LncRNA BCYRN1在不同转归患儿血清中的表达状况
QRT-PCR检测LncRNA BCYRN1在不同转归患儿血清中的表达，成果提示随访2年期间120例哮喘患儿中完全缓解28例（其间男性15，女人13例），好转42例（其间男性20，女人22例），继续25例（其间男性15，女人10例），加剧25例（其间男性15，女人10例）。LncRNA BCYRN1随转归加剧呈升高趋势，差异有统计学含义（P<0.05）（图2）。
2.3 LncRNA BCYRN1的表达与炎性因子IgE、IL-4和TNF-α的相关性
哮喘患儿血清中LncRNA BCYRN1的表达与炎性因子TNF-α、IL-4、IgE的表达到正相关（r=0.712，P<0.001；r=0.770，P<0.001；r=0.748，P<0.001）（图3）。
3评论
哮喘是一种常见的缓慢气道炎症性疾病，其特征是重复发生性喘息、可逆的气道梗阻和气道重塑。哮喘发生的根本原因尚不清晰，医治以对症医治为主。哮喘发病机制触及组织学、分子和基因改动及蛋白表达，近年来非编码RNA（ncRNA）在哮喘病因学的研讨中也逐步受到重视，其可能为哮喘的病理研讨和医治办法带来根本性改动[13-15]。
LncRNA是真核细胞中的一类转录本长度超越200 nt的非编RNA，无蛋白编码功用，在哺乳动物基因组中遍及被转录[16]。LncRNA曾被认为是转录进程中的副产品，不具有生物学功用。但现在越来越多的研讨证明LncRNA具有重要的生物学功用，其在剂量补偿效应、表观遗传调控、细胞分解和细胞周期调控等生命活动中发挥重要效果[17-18]。LncRNA具有多样生物学功用：参加X染色体失活，调控mRNA降解，构成细胞核亚结构骨架，作为染色质重塑的调控因子等，而且与人类疾病的发生开展有密切联系[19-21]。研讨标明LncRNAs具有多样的生物学功用，其机制首要有染色质重塑、基因印记、细胞周期调控和翻译调控等[22]，但是正因为LncRNAs效果机制的多样性和复杂性，现在关于LncRNAs的效果机制的了解也仅仅冰山一角，关于其调控与被调控机制仍需求进一步的研讨。现在的研讨多会集在肿瘤方面，关于LncRNA与小儿哮喘的联系现在国内外报导尚少。本研讨挑选2012年1月～2015年12月随访的120例稳定时哮喘患儿（间歇发生30例、轻度继续发生30例、中度继续发生30例、重度继续发生30例）和30例健康儿童作为对照进行研讨。收集各组研讨目标入组时及随访完毕时的血清样本选用实时荧光定量PCR检测哮喘患儿及健康对照儿童血清中LncRNA BCYRN1的表达水平，剖析LncRNA BCYRN1的表达对患儿预后的影响，重在评论小儿哮喘中LncRNA的炎症调控机制。成果发现LncRNA BCYRN1在哮喘患儿血清中的表达较对照组显着增高，LncRNA BCYRN1随病况加剧表达水平逐步升高，LncRNA BCYRN1随转归加剧呈升高趋势，LncRNA BCYRN1的表达与炎性因子TNF-α、IL-4、IgE的表達成正相关。
综上所述，LncRNA BCYRN1表达水平与小儿哮喘病况有关，可作为判别预后的目标，对临床小儿哮喘预后的判别具有必定效果。但由于本研讨的临床病例有限，关于LncRNA BCYRN1对小儿哮喘的影响需要扩展样本量及分子生物学试验进一步研讨。
[参考文献]
[1]Han YY，Forno E，Gogna M，et al.Obesity and rhinitis in a nationwide study of children and adults in the United States[J].J Allergy Clin Immunol，2016，137（5）：1460-1465.
[2]Hsu J，Qin X，Beavers SF，et al.Asthma-related school absenteeism，morbidity，and modifiable factors[J].Am J Prev Med，2016，51（1）：23-32.
[2]Dinakar C，Chipps BE.Clinical tools to assess asthma control in children[J].Pediatrics，2017，139（1）.pii：e20163438.
[4]Dutmer CM，McGraw MD，Liu A.HInner-city asthma：special considerations for management[J].Curr Opin Allergy Clin Immunol，2016，16（2）：148-156.
[5]Omran A，Elimam D，Yin F.MicroRNAs：new insights into chronic childhood diseases[J].Biomed Res Int，2013，2013（3）：291826.
[6]Hong HH，Hou LK，Pan X，et al.Long non-coding RNA UCA1 is a predictive biomarker of cancer[J].Oncotarget，2016，7（28）：44442.
[7]Hu L，Chen SH，Lv QL，et al.Clinical significance of long Non-Coding RNA CASC8 rs10505477 polymorphism in lung cancer susceptibility，platinum-based chemotherapy response，and toxicity[J].Int J Environ Res Public Health，2016，13（6）：545.
[8]Persson H，Kwon AT，Ramilowski JA，et al.Transcriptome analysis of controlled and therapy-resistant childhood asthma reveals distinct gene expression profiles[J].J Allergy Clin Immunol，2015，136（3）：638-648.
[9]Perry MM，Tsitsiou E，Austin PJ，et al.Role of non-coding RNAs in maintaining primary airway smooth muscle cells[J].Respir Res，2014，15（1）：1-12.
[10]■nell A，Whiteman A，Nordlund B，et al.Allergy testing in children with persistent asthma：comparison of four diagnostic methods[J].Allergy，2016，72（4）：590-597.
[11]Sánchez T，Castrorodríguez JA，Brockmann PE.Sleep-disordered breathing in children with asthma：a systematic review on the impact of treatment[J].J Asthm Allergy，2016，9（Issue 1）：83-91.
[12]Gern J.EViral and bacterial infections in the development and progression of asthma[J].J Allergy Clin Immunol，2000， 105（2 Pt 2）：S497-S502.
[13]Bostantzoglou C，Delimpoura V，Samitas K，et al.Clinical asthma phenotypes in the real world：opportunities and challenges[J].Breathe （Sheff），2015，11（3）：186-193.
[14]Houtsma A，Bedenice D，Pusterla N，et al.Association between inflammatory airway disease of horses and exposure to respiratory viruses：a case control study[J].Multidiscip Respir Med，2015，10（1）：1-11.
[15]Ritchie AI，Farne HA，Singanayagam A，et al.Pathogenesis of viral infection in exacerbations of airway disease[J].Ann Am Thorac Soc，2015，2：115-32.
[16]Khanduja JS，Calvo IA，Joh RI，et al.Nuclear noncoding RNAs and genome stability[J].Mol Cell，2016，63（1）：7-20.
[17]Deng H，Zhang J，Shi J，et al.Role of long non-coding RNA in tumor drug resistance[J].Tumour Biol，2016，37（9）：1-9.
[18]Duval M，Cossart P，Lebreton A.Mammalian microRNAs and long noncoding RNAs in the host-bacterial pathogen crosstalk[J].Semin Cell Dev Biol，2016.pii：S1084-9521（16）30162-8.
[19]Leone S，Santoro R.Challenges in the analysis of long noncoding RNA functionality[J].Febs Letters，2016，590（15）：2342.
[20]Serghiou S，Kyriakopoulou A，Ioannidis JP.Long noncoding RNAs as novel predictors of survival in human cancer：a systematic review and meta-analysis[J].Mol Cancer，2016，15（1）：50.
[21]Sun X，Wong D.Long non-coding RNA-mediated regulation of glucose homeostasis and diabetes[J].Am J Cardiovasc Dis，2016，6（2）：17-25.
[22]Zhang C，Gao L，Xu EY.LncRNA，a new component of expanding RNA-protein regulatory network important for animal sperm development [J].Semin Cell Dev Biol，2016，59：110-117.
（收稿日期：2017-01-03 本文編辑：任 念）
