姚伟城 江琼 胡诚亮
[摘要] 意图 研讨神经调理蛋白-1（Nrg1）对脊髓损害修正相关分子表达的影响并开始评论其分子机制。 办法 将12只3个月龄C57BL/6雌性小鼠随机分红对照组和Nrg1给药组，每组6只，经过压榨性脊髓损害后，经过鼠尾静脉打针别离接连给予DMSO溶剂和重组Nrg1β（rNrg1β）7 d，正常养殖6周后取其损害部位脊髓样本进行蛋白免疫印迹（Western blot）检测Nrg1受体及相关分子蛋白的表达，比较两组间差异。 成果 与对照组比较，Nrg1给药组Nrg1受体ErbB4和Neu的磷酸化水平有所升高，其间ErbB4磷酸化水平明显升高（P<0.01）；Nrg1给药组神经再生相关分子mTOR和Bcl-2表达明显升高（P<0.05），而不利于损害后修正的分子PTEN、GFAP和Bax的表达下降。 定论 经过外源性给予Nrg1激活其受体ErbB4和Neu，可升高小鼠脊髓损害后神经再生相关分子mTOR磷酸化激活和Bcl-2蛋白水平，下调按捺脊髓损害后修正相关分子PTEN、GFAP和Bax蛋白水平，这些效果可能是经过激活Erk信号通路完成的。
[要害词] 神经调理因子-1；脊髓损害；修正；分子机制
[中图分类号] R363 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）04（b）-0004-04
[Abstract] Objective To study the effects of Neuregulin-1 （Nrg1） on the expression of molecules associated with repair of spinal cord injury in mice and to preliminarily explore the related molecular mechanism. Methods Twelve 3-month-old C57BL/6 female mice were evenly divided into control group and Nrg1 group，and each group contained 6 mice.Mice were administrated with either DMSO solvent or Nrg1β diluted in DMSO by tail vein injection for 7 consecutive days after spinal cord injury.Tissues within the injury site were collected for performing western blot to measure the expression level of the molecules involved after 6 weeks of routine feeding.The differences between two groups were compared. Results Compared with the control group，the phosphorylation levels of Nrg1 receptors ErbB4 and Neu were significantly elevated in the Nrg1 group （P<0.01）.The protein levels of pmTOR and Bcl-2 were also significantly increased by Nrg1 when compared with the control group （P<0.05） and the levels of PTEN，GFAP and Bax were apparently decreased in the Nrg1 group. Conclusion The phosphorylation levels of Nrg1 receptors ErbB4 and Neu can be increased by exogenous Nrg1.The protein levels of regeneration-promoting molecules after spinal cord injury，including pmTOR and Bcl-2，are elevated，whereas those of the regeneration-inhibiting molecules，including PTEN，GFAP and Bax，are reduced by exogenous Nrg1.These effects may be achieved by the activation of Erk1/2 signaling pathways.
[Key words] Neuregulin 1；Spinal cord injury；Repair；Molecular mechanism
脊髓损害是严峻的中枢神经系统伤口性疾病，在全球出现出高发生率、高致残率、高消耗和低龄化的“三高一低”局势，是亟待解决的严峻医学难题。现在，因为缺少有用的修正机制并遭到很多按捺分子的影响，成年哺乳动物的脊髓在损害后无法恢复，然后导致严峻的运动功用障碍和难以忍受的苦楚。当时药物疗法的效果非常有限，尚不能很好地促进患者脊髓损害后的自行恢复。脊髓损害的医治手法非常有限，尚无突破性发展，且临床医治中仍以骨折复位固定为主，药物医治中以大剂量甲基强地松龙（MP）运用较多。可是，近年来大剂量MP运用引起的感染及消化道出血等潜在危险也逐步引起了人们的重视[1]。因而，针对脊髓损害的医治战略亟需深化的研讨。
神经调理蛋白（neuregulin，Nrg）宗族是一类调理成长和分解的多肽类神经成长因子，归于表皮成长因子超宗族成员。Nrg宗族蛋白都含有类似的结构域，包含免疫球蛋白样环状结构、表皮成长因子（EGF）样结构域、跨膜区和犬牙交错的胞内结构域。Nrg1是神经调理蛋白宗族的成员之一[2-3]，首要由神经元和神经胶质细胞排泄[4-5]。Nrg1的EGF样结构域与受体ErbB蛋白结兼并激活ErbB受体的酪氨酸激酶活性，然后触发下流信号通路，激活一系列细胞内生物学级联反响[6-8]，包含影响神经干细胞分解、神经元搬迁、轴突再生以及突触构成[9-10]。已有研讨标明，在哺乳动物神经系统中Nrg1表达首要以Nrg1β为主，其β型EGF样结构域与ErbB4受体结合调控神经元成长、存活和代谢[11]。本研讨经过小鼠脊髓损害后经尾静脉打针外源性Nrg1β，运用蛋白免疫印迹（Western blot）检测促进神经再生相关分子mTOR和Bcl-2，以及不利于损害后修正的分子PTEN、GFAP和Bax表达的改变，在蛋白水平上评论Nrg1对小鼠脊髓损害后修正的影响。
1材料与办法
1.1试验动物
健康野生型3个月龄SPF级雌性C57BL/6小鼠12只，购自广东省医学试验动物中心，体质量19～23 g，均匀20 g，动物质量合格证号为SCXK（粤）2008-0002。试验动物养殖于汕头大学医学院试验动物中心，室内环境稳定温度25℃，每12小时漆黑/光照循环替换，动物自在摄食、饮水。所用动物试验操作均遵从汕头大学医学院动物道德委员会的相关规定，尽量削减试验动物的苦楚并最大极限地削减试验动物的用量。
1.2首要仪器与试剂
外源性重组Nrg1β（rNrg1β，CYT-407，ProSpec-Tany TechnoGene公司，以色列）溶解在0.1%的DMSO（MP Biomedicals公司，法国）中，并用生理盐水稀释至2.5 nmol/L。兔抗pErbB4（1∶500，sc-33040），兔抗ErbB4（1∶1000，sc-283），兔抗pNeu（1∶500，sc-12352-R），小鼠抗Neu（1∶1000，sc-33684），小鼠抗pErk1/2（1∶1000，sc-7383），小鼠抗Erk1/2（1∶1000，sc-135900），小鼠抗pAkt1（1∶1000，sc-81433），小鼠抗Akt1（1∶1000，sc-55523），兔抗Bax（1∶1000，sc-526），小鼠抗Bcl-2（1∶1000，sc-7382），兔抗mTOR（1∶500，sc-8319），兔抗pmTOR（1∶500，sc-101738），小鼠抗PTEN（1∶1000，sc-7974），以及小鼠抗β-actin抗体（1∶1000，sc-47778）均购自美国Santa Cruz公司。兔抗GFAP抗体（1∶1000，BA0056）购自武汉博士德生物公司。
1.3 小鼠脊髓损害动物模型的制备
将3个月龄野生型C57BL/6雌性小鼠随机分红对照组和Nrg1给药组，每组6只，经过腹腔打针麻醉剂（氯胺酮100 mg/kg；甲苯噻嗪5 mg/kg）使其深度麻醉，剔去背部毛发，将小鼠俯卧位固定于手术台上，75%乙醇消毒，行背中段正中切断，以T8为中心，长约2 cm顺次切开皮肤，皮下安排，锐性切开椎旁肌并向两边别离，露出T8～L1椎体棘突及椎板，纹式钳当心咬除T9～T11棘突及全椎板。以T10为中心（定位：经过计数肋骨发现小鼠椎体棘突特色为T9棘突斜向尾侧，T11斜向头侧，T10中立）用镊子100%彻底压榨脊髓5 s，构成脊髓损害，致伤瞬间，小鼠痉挛性摆尾，双下肢及躯体回缩扑动后双下肢瘫痪，此为造模成功标志。然后止血，盐水冲刷，以0号线逐层缝合。术毕在创伤撒少量青霉素粉，以防感染。稍后腹腔打针生理盐水200 μl，30 min后待小鼠逐步清醒，每天同一时间点经过鼠尾静脉打针200 μl 2.5 nmol/L的Nrg1β，接连给药7 d，分笼养殖，且每天进行2次人工揉捏膀胱排尿，6周后选材进行试验。
1.4 Western blot试验
于脊髓损害后6周，取损害区中心上下流0.25 cm（总长0.5 cm）部分脊髓为新鲜安排样本，当即干冰保存。运用安排裂解液并经过匀浆器裂解安排，提取蛋白质，按4∶1体积比与上样缓冲液混合，95 ℃变性10 min，加样，积层胶（5%，质量分数）中恒压80 V电泳，进入别离胶（10%，质量分数）后改恒压120 V，之后湿转，恒流300 mA转膜3 h，以质量分数5%的TBST脱脂奶粉或BSA缓冲液室温关闭1 h，之后运用不同浓度一抗与PVDF膜孵育，4℃振动孵育过夜后用HRP符号的相应二抗（1∶1000）室温孵育1 h。每次孵育完毕后以TBST洗膜3次，每次5 min。用ECL超敏发光法检测蛋白质表达，凝胶图画剖析仪收集化学发光信号。为评论Nrg1介导小鼠脊髓损害修正的分子机制，本研讨选取Nrg1-ErbB信号转导的下流通路中MAPK-Erk和PI3K-Akt两条信号通路打开，一起检测激活型Akt1（pAkt1）和激活型Erk1/2（pErk1/2）的蛋白水平改变。
1.5计算学剖析
选用Imag J软件丈量信号条带灰阶值，并运用计算软件SPSS 18.0对试验数据进行剖析，计量材料以均数±标准差（x±s）标明，选用t查验。计数材料以率标明，选用χ2查验，以P<0.05为差异有计算学含义。
2 成果
2.1 Nrg1受体ErbB4、Neu在脊髓损害中心区的表达及其磷酸化水平改变
Western blot检测对照组和Nrg1给药组的ErbB4和Neu磷酸化蛋白水平改变，成果6周后，与对照组比较Nrg1对小鼠损害脊髓中的Nrg1受体原型无明显影响，但两受体的磷酸化蛋白水平较对照组均出现增高趋势，其间Nrg1可明显增高ErbB4蛋白磷酸化水平（P<0.01）（图1），提示Nrg1可磷酸化脊髓内相应受体，增高其活性。
2.2 Bcl-2、mTOR的蛋白及其磷酸化水平改变
Western blot检测Bcl-2和pmTOR的蛋白水平改变状况，成果与对照组比较，Nrg1给药组可明显上调Bcl-2和pmTOR蛋白水平（P<0.05）（图2），提示Nrg1可促进神经再生相关分子mTOR和Bcl-2的表达水平升高。
2.3 PTEN、GFAP和Bax在脊髓损害中心区蛋白的表达水平改变
Western blot检测成果显现，与对照组比较，Nrg1按捺肿瘤细胞标志物PTEN蛋白的表达（图3A），一起对星形胶质细胞标志物GFAP的蛋白表达（图3B）和促凋亡蛋白Bax的表达水平（图3C）也有必定的下调效果。
2.4 Akt和Erk在脊髓损害中心区的蛋白表达水平改变
Western blot试验成果显现，与对照组比较，rNrg1对Akt分子以及pAkt的蛋白水平影响不明显（图4A），而给予Nrg1可稍微下调Erk1/2的蛋白表达，一起添加Erk1/2蛋白的磷酸化水平（图4B）。
3 评论
Nrg1经过结兼并激活其受体ErbBs二聚体，活化下流信号通路分子，如ERK和PI3K等，进而参加一系列的细胞内信号转导进程[12]，且Nrg1-ErbB信号通路的激活在神经发育和细胞的增殖分解等生命进程中发挥重要效果[13-14]。脊髓损害后，损害部位会发生胶质瘢痕乃至构成空泛、囊性变等病理改变，导致修正进程中神经纤维很难穿越胶质瘢痕区域。一起脊髓损害也会引起很多神经元轴突的损害，乃至神经元逝世，终究损害区近端不能与脊髓远端树立信号联络[15]。本研讨中，经过给予外源性Nrg1β医治小鼠脊髓损害，成果ErbB4、Neu的磷酸化水平明显高于对照组，标明经过给予rNrg1可激活损害脊髓中Nrg1-ErbB信号通路。可是，Nrg1-ErbB信号通路的激活是否会参加到脊髓损害修正的调控进程？依据脊髓损害后病理生理特性以及已知Nrg1-ErbB信号通路的功用，本研讨对给予Nrg1后神经再生相关分子Bcl-2、mTOR和脊髓损害修正按捺分子PTEN、GFAP和Bax的蛋白水平改变进行了开始研讨。检测成果显现，Nrg1给药组Bcl-2和mTOR的表达较对照组明显升高，一起，PTEN、GFAP和Bax的分子表达水平较对照组明显下降，上述成果提示给予rNrg1对脊髓损害再生相关分子的蛋白表达有调控效果。在本研讨中，笔者在蛋白水平上整体量化相关分子的表达改变，但并未对这些分子在脊髓损害后的表达和散布做进一步的形态学研讨。因而，未来笔者将选用免疫荧光双标染色技能来进一步探求Nrg1调控的这些分子在脊髓损害后分子表达的细胞类型和散布区域，然后在亚细胞水平找到相应的蛋白共定位依据。在神经系统的发育中，Akt1是神经元存活的要害分子，Akt1的磷酸化会使凋亡途径失活，而细胞外调理蛋白激酶Erk1/2是将信号从外表受体传导至细胞核的要害。研讨标明Nrg1与其受体ErbB结合可发动Erk等激酶信号转导途径[12]，参加神经元的存活和神经突起的成长[16]。在本研讨成果中，Nrg1给药组Akt1的蛋白磷酸化水平较对照组无明显差异，而Erk1/2的蛋白磷酸化水平较对照组有升高趋势，提示Nrg1激活Nrg1-ErbB信号通路后上调有益于神经元修正相关分子，下调脊髓损害修正按捺分子的蛋白水平表达，可能首要经过Erk信号通路完成的，对Akt信号通路的影响不明显。Nrg1在脊髓损害医治中的效果，尤其是对行为学改进的影响，有待经过动物模型试验进一步求证。
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（收稿日期：2016-01-14 本文修改：卫 轲）
