秦薇
[摘要] 意图 研讨宫颈癌中HPV感染与Rap1GAP基因及蛋白水平改动的联络。办法 以我院收治的70例宫颈癌患者为调查组，另选正常宫颈安排70例为对照组。别离对两组方针的宫颈安排进行DNA提取、总RNA提取、cDNA组成、PCR反响扩增。并检测HPV感染、Rap1GAP基因外显子E11和E19缺失率、Rap1GAP mRNA表达及Rap1GAP蛋白表达状况。 成果 调查组患者HPV感染显着高于对照组（P <0.05）。调查组HPV阳性和阴性组E11和E19的缺失率比较，差异无统计学含义（P >0.05）。Rap1GAP mRNA、Rap1GAP蛋白在调查组HPV阳性组安排中的表达率、阳性表达率显着低于HPV阴性组（P <0.05）。宫颈癌中HPV感染与Rap1GAP mRNA的表达呈正相关（r=0.578），与Rap1GAP 蛋白的阳性表达呈正相关（r=0.554）。 定论 宫颈癌中HPV感染与Rap1GAP mRNA的表达呈正相关，与Rap1GAP 蛋白的阳性表达呈正相关。
[要害词] 宫颈癌；HPV感染；Rap1GAP基因；Rap1GAP蛋白；联络
[中图分类号] R737.33 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）20-0037-04
在临床上，肿瘤一直是一种死亡率较高的病症，肿瘤疾病的开展进程，首要依托一系列基因以及多阶段致癌，进程相对杂乱，其发作机制首要是因为原癌基因被激活以及抑癌基因失活所造成的。在肿瘤疾病中，宫颈癌是一种常见的妇科恶性肿瘤疾病，是仅次于乳腺癌的肿瘤疾病，多发于开展中国家。而在近几年来，宫颈癌的发病集体日益扩展，年青集体也存在着发病趋势。宫颈癌的发病诱因一般与多个要素影响有关，包含病毒感染、早婚早育、多产吸烟以及不良性行为等。Rap1GAP是近年来最新发现的与宫颈癌相关的按捺基因，其基因及蛋白水平的表达与宫颈癌安排HPV感染是否有关成为临床评论的重要课题[1-8]。本文以我院2011年1月～2013年1月收治的70例宫颈癌患者为研讨方针，评论宫颈癌中HPV感染与Rap1GAP基因及蛋白水平改动的联络，现报导如下。
1材料与办法
1.1临床材料
挑选我院2011年1月～2013年1月收治的70例宫颈癌患者为调查组，一切患者均经手术病理证明为宫颈癌，年纪 28～65 岁，均匀（45.4±5.4）岁。另选正常宫颈安排70例为对照组，年纪 27～63 岁，均匀（46.7±6.3）岁。两组患者在年纪等一般材料的比较上，差异不存在统计学含义 ，具有可比性。
1.2试剂、仪器和办法
取两组方针的宫颈安排均分为2块，一块用10%甲醛予以固定，白腊包埋。另一块速冻后置冰箱待检。
1.2.1首要试剂和仪器 首要试剂：RT-PCR 试剂盒、琼脂糖、Trizol试剂、DEPC、EB等；首要仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶图画剖析体系、离心机、免疫组化对照体系等。
1.2.2办法 ①DNA的提取 依据试剂盒的操作阐明，别离取两组的安排标本进行离心，洗脱DNA，于4℃温度下保存备用。②总RNA提取 别离取两组冷冻的安排标本离心处理，用DEPC水溶解RNA，选用凝胶成像体系对RNA的表达进行检测。③cDNA组成 依据试剂盒的操作阐明，以提取的总RNA为模版，以随机引物做引物，进行cDNA组成。④引物规划 对Rap1GAP、β-actin及Rap1GAP的11号和19号外显子进行引物规划，引物规划办法见文献[2]。⑤PCR反响扩增 依据PCR仪的操作阐明进行PCR反响扩增。⑥电泳及Rap1GAP mRNA表达 别离取两组3μL的Rap1GAP、β-actin的反响产品和Rap1GAPE11和E19的扩增产品在琼脂糖凝胶上进行电泳[6]。选用凝胶图画剖析体系对电泳成果进行剖析，检测Rap1GAP mRNA的表达成果[7]。⑦HPV感染检测 选用免疫安排化学法别离对两组方针安排中的HPV感染进行检测。感染断定规范[8]：阳性：细胞浆或细胞核出血棕黄色颗粒，5个高倍视界调查下，HPV（+）为阳性细胞>30%[3]。⑧Rap1GAP蛋白的表达检测 将已知胃癌的安排切片作为Rap1GAP蛋白的阳性对照[4]。
1.3调查方针
①HPV感染状况；②调查组安排中Rap1GAP基因外显子E11和E19的检测成果；③调查组患者宫颈癌安排中Rap1GAP mRNA表达检测成果；④调查组患者宫颈癌安排中Rap1GAP蛋白表达检测成果。
1.4统计学办法
选用SPSSl0.0统计学软件，计量材料用（x±s）标明，组间比较应选用t查验，计数材料选用χ2查验，选用Spearman相联络数剖析， P<0.05标明差异有统计学含义。
2成果
2.1 HPV感染状况
调查组70例患者中，53例患者HPV感染，HPV感染率为75.71%；对照组70例方针中，11例HPV感染，HPV感染率为15.71%。调查组患者HPV感染显着高于对照组（χ2=4.32，P<0.05）。
2.2 调查组安排中Rap1GAP基因外显子E11和E19的检测成果
调查组70例患者中，53例HPV阳性组E11和E19的缺失率均为7.55%；17例HPV阴性组E11和E19的缺失率均为11.76%。调查组HPV阳性和阴性组E11和E19的缺失率比较，差异无统计学含义（χ2=1.22，P>0.05）。因而，宫颈癌患者安排中Rap1GAP基因外显子E11和E19的缺失与HPV感染无显着相关性（r=0.816，P>0.05）。见表1。
表1 调查组安排中Rap1GAP基因外显子E11和E19的检测成果[n（%）]
2.3调查组患者宫颈癌安排中Rap1GAP mRNA表达检测成果endprint
调查组70例患者，其间53例HPV阳性组安排中Rap1GAP mRNA的表达率为0（0/53）；17例HPV阴性组安排中Rap1GAP mRNA的表达率为70.59%（12/17）。Rap1GAP mRNA在调查组HPV阳性组安排中的表达率显着低于HPV阴性组。因而，宫颈癌中HPV感染与Rap1GAP mRNA的表达呈正相关（r=0.578）。
2.4调查组患者宫颈癌安排中Rap1GAP蛋白表达检测成果
调查组70例患者，其间53例HPV阳性组安排中Rap1GAP蛋白阳性的表达率为9.43%（5/53），17例HPV阴性组安排中Rap1GAP蛋白阳性的表达率为35.29%（6/17）。Rap1GAP蛋白在调查组HPV阳性组安排中的阳性表达率显着低于HPV阴性组。因而，宫颈癌中HPV感染与Rap1GAP 蛋白的阳性表达呈正相关（r=0.554）。
3 评论
现在，跟着人们日子方式以及饮食结构的日益改变，宫颈癌的发作率也不断上升，对广阔妇女的日子、作业以及学习造成了严峻的影响。高危型HPV感染是宫颈癌中一个重要的要素。但是，HPV导致宫颈癌分子生物学的机制在现在尚不清晰。相关研讨显现，E6TP1在HPV感染的宫颈癌患者中，表达水平显着下降。因而猜想Rap1GAP与HPV感染在临床上存在亲近的联络，与宫颈癌的发作开展的分子生物学机制有关[5]。
经过克隆判定，现在存在有100多种HPV，其间有30多种首要来源于受感染的生殖道安排的别离[6]。结合HPV的致病才能，可以将其划分为低危型以及高危型两种。其间低危型的HPV首要包含HPV-6、HPV-11、HPV-30、HPV-42、HPV-43以及HPV-44，可引起生殖道外生性扁平疵类病变以及低度宫颈上皮内瘤样病变，即CIN1级；而高危型HPV首要包含了HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58以及HPV-61，高危型HPV首要会引起高度宫颈上皮内瘤样病变以及宫颈癌，高危型HPV中首要以HPV-16以及HPV-18为主，在CIN以及滋润癌中比较常见[7]。
HPV作为一种肿瘤病毒，其体型较小，且细胞结构上不存在胞膜，存在双链闭环DNA基因组，长度为7900bp，编码蛋白首要包含了E1、E2、E3、E4、E5、E6、E77种[8]。在这些编码蛋白中，E6和E7与肿瘤恶化转化以及永生化有关。一起，E6和E7与细胞癌基因以及抑癌基因会彼此效果，亦成为导致HPV致癌的一个要害点。E7蛋白一般存在于宿主细胞的细胞核内部，与肿瘤按捺基因Rb蛋白彼此结合，对细胞周期的调理进行影响，一起还会搅扰DNA的修正，导致细胞出现不稳定性[9]。而E6蛋白则首要坐落宿主细胞的细胞膜以及细胞核内部，当E6与P53彼此结合后，P53会对泛蛋白-蛋白酶体体系进行降解，然后使其损失抑癌效果，引起细胞的增殖[10]。
宫颈HPV感染与患者的年纪存在联络，一般多发年纪段为15～25岁的集体，关于30岁以上以及绝经后的集体，HPV的感染率会削减，单一性伴侣的妇女，其HPV感染率也相对较低[11]。正常状况下，宫颈安排的HPV检出率为11%到37%，而宫颈癌的HPV检出率则为75%，可见，HPV在正常安排以及宫颈癌中均存在较高的感染率[12]。
跟着分子生物学和分子流行病学的迅速开展，病毒感染与肿瘤的联络日益遭到广泛注重。HPV是一种细小的DNA病毒，现在，相关临床研讨证明，HPV感染是诱发宫颈癌的首要病因和必要条件[13]。Rap1GAP是近年来最新发现的与宫颈癌相关的按捺基因，是Rap1特异的GTP酶活化蛋白，经过对Rap1的催化，而使从有活性的GTP结合方式向无活性的GDP方式改变。而Rap1作为小分子G蛋白，在细胞的多种功用中发挥了参加效果，可以对细胞的增殖、分解进行调理[13]。因而，其活性的强弱与肿瘤的发作、开展亲近相关。因而，Rap1GAP作为调控Rap1活性的前言，其与肿瘤的发作开展也会有亲近联络。因而，Rap1GAP是否像E6TP1相同参加了HPV的效果机制，进而影响宫颈癌的发作、开展是近年来临床医学研讨的热门[14]。
相关临床研讨报导[15，16]，经过酵母杂交技能发现HPV宗族的中E6与Rap1GAP宗族成员中的E6可彼此效果，即在HPV感染的发作机制中，Rap1GAP宗族成员中E6TP1羧基结尾的40个氨基酸残基可与HPV宗族的中E6相结合，且结合后会被泛素化，并在蛋白酶的效果下被降解，然后使Rap1的活性被激活，然后构成Rap1通路，导致肿瘤的构成[15]。因而，可以发现HPV感染的发作与Rap1GAP亲近相关。一起，还有相关研讨报导证明，Rap1GAP蛋白反过来会对Rap1起操控效果[16]。Rap1GAP的基因是ID（DNA结合的按捺因子）蛋白的一个直接方针。当存在ID蛋白时，Rap1GAP启动子被封闭，但是当ID蛋白缺少时，可与ID蛋白彼此效果的bHLH因子可以与Rap1GAP启动子相结合，并将其激活。且Id-Rap1GAP-Rap1信号通路在神经干细胞的保持更新中发挥了重要的效果。因而，Rap1GAP 蛋白在活的有机体中按捺了Rap1GAP表达，然后保持活化的Rap1，Rap1GAP蛋白的表达与Rap1GAP的活性出现正相关。Rap1GAP含25个外显子，编码663个氨基酸，其GAP活性区在75～416个氨基酸之间，故本试验挑选Rap1 GAP活性区域中的E11和E19来剖析Rap1GAP在宫颈癌中的表达机制。PCR扩增Rap1GAP基因外显子E11和E19，正常宫颈安排中Ell和E19无缺失，宫颈癌中Ell及E19的检出率与正常宫颈安排的检出率无显着差异，标明Ell和E19在宫颈癌中无缺失。宫颈癌HPV阳性组E11及E19的缺失与HPV阴性组也无显着不同，因而，HPV感染与E11及E19在宫颈癌的缺失无相关。endprint
