周敬纲
[摘要] 意图 了解动物源性大肠埃希菌超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的检出率和耐药特色，为其耐药性的安全点评供给根据。 办法 选用NCCLS引荐的表型检测法和承认实验测定大肠埃希菌ESBLs，纸片分散法测定大肠埃希菌的耐药性。 成果 222株大肠埃希菌对环丙沙星（83.78%）、诺氟沙星（92.79%）、利福平（81.08%）的耐药率很高；对阿米卡星、亚胺培南高度灵敏。ESBLs检出率为12.16%（27/222），产ESBLs菌株除对亚胺培南外其他13种抗生素的耐药率均高于非产ESBLs菌株。 定论 动物源性大肠埃希菌对许多抗生素具有必定的耐药性，应加强对食物中动物源性大肠埃希菌耐药性的监测。
[关键词] 大肠埃希菌；动物源食物；耐药性
[中图分类号] R378.2+1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）12（b）-0008-04
食物安全是全世界遍及注重的问题，其关系到人民群众的身体健康和生命安全。近年来，因为抗生素的乱用，呈现越来越多的耐药菌株，且耐药谱越来越广[1]，对感染性疾病的临床医治构成威胁。大肠埃希菌是食物污染监测的首要方针菌，是人类和动物肠道中的正常栖居菌，具有致病性，条件致病性和非条件致病性等多样性特色，临床上，大肠埃希菌引起感染的现象日趋严重，耐药菌株不断增多，其间产超广谱β-内酰胺酶（extended spectrum beta-lactamases，ESBLs）大肠埃希菌是对β-内酰胺类抗生素耐药的首要病原菌。在动物源性食物的加工过程中，很简单遭到大肠埃希菌的污染，并传递给人类，因而对动物源性大肠埃希菌耐药性和ESBLs检测具有重要含义。本文经过对食物污染风险监测中由动物源性食物中别离到的大肠埃希菌进行药敏实验，了解本地动物源性食物中大肠埃希菌的耐药性和ESBLs的发生情况，为临床抗生素运用供给参阅。
1 材料与办法
1.1 菌株来历
2011年6月～2013年9月食物污染风险检测中源自鸡源、猪源、牛源食物中的大肠埃希菌222株，其间鸡肉源72株，鸡蛋源53株、猪肉源82株、牛肉源10株、生牛奶源5株。
1.2 菌株的别离程序
1.2.1 样品的稀释 取动物源食物25 g放入盛有225 ml磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器敲打1～2 min制成1∶10的样品匀液。调pH值至6.5～7.5。用1 ml无菌吸管汲取1∶10样品匀液1 ml，沿管壁慢慢注入9 ml磷酸盐的缓冲液，混匀，制成1∶100的样品匀液。根据对样品污染情况的估量，按上述操作，顺次制成10倍递加系列稀释样品匀液。
1.2.2 初发酵实验 挑选3个适合的接连稀释度的样品匀液，每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1 ml，（36±1） ℃培育（24±2） h，产气管进行复发酵实验。
1.2.3 复发酵实验 用接种环从产气的LST肉汤管中取培育物1环，移种于已提早预温至45℃的EC肉汤管中，放入带盖的（44.5±0.2） ℃水浴箱内，水浴的水面应高于肉汤培育基液面，培育（24±2） h，产气管，进行EMB平板别离培育。
1.2.4 EMB平板别离 用接种环取培育物划线接种于EMB平板，（36±1）℃培育18～24 h，挑取具黑色中心有金属光泽或无金属光泽的典型菌落进行断定。
1.2.5 断定 IMViC实验，选取成果为﹢﹢﹣﹣、﹣﹢﹣﹣、﹢﹢﹣﹢、﹣﹢﹣﹢的方针菌落进行ESBLs检测和药敏实验。
1.3 ESBLs检测
ESBLs表型检测办法，选用美国临床实验室规范化委员会（NCCLS）引荐的规范纸片琼脂分散法，承认实验选用双纸片法，抗生素为头孢他定30 μg，头孢他定/克拉维酸30 μg/10 μg，头孢噻肟30 μg，头孢噻肟/克拉维酸30 μg/10 μg。培育基为M-H琼脂。成果判读：任何一种药物在参加克拉维酸后，抑菌圈直径与不参加克拉维酸的抑菌圈比较增大值≥5 mm，判别为产ESBLs大肠埃希菌。
1.4 药敏实验
选用VITEK32细菌断定仪对别离菌株进行断定，纸片分散法（K-B法）进行药敏实验，药敏实验质控菌株为大肠埃希菌（ATCC25922）。抗生素挑选如下。青霉素类：氨苄西林（AMP）；头孢菌素类：头孢噻吩（CFT）、头孢曲松（CTX）；氨基糖苷类：庆大霉素（GEN）、阿米卡星（AMK）；四环素类：四环素（TET）、强力霉素（DOTC）；氯霉素类：氯霉素（CHL）；磺胺类：甲氧苄啶（TRI）；甲氧苄啶/磺胺甲唑（SXT）；喹诺酮类：环丙沙星（CIP）、诺氟沙星（NOR）；碳青霉烯类：亚胺培南（IPM），其他：利福平（RIF）。实验成果按NCCLS规范断定。
1.5 计算学处理
选用SPSS 13.0计算软件对数据进行处理，计数材料选用χ2查验，以P<0.05为差异有计算学含义。
2 成果
2.1 药敏实验成果
222株大肠埃希菌对CIP（83.78%）、NOR（92.79%）、RIF（81.08%）的耐药率很高；对GEN（32.43%）、SXT（12.16%）耐药率较高；对AMP（9.01%）、CFT（6.31%）、CTX（4.95%）、TET（7.21%）、DOTC（4.50%）、CHL（5.41%）、TRI（3.60%）的耐药率介于3.60%～9.01%；对AMK（0.90%）、IPM（0.00%）高度灵敏。猪肉源和牛肉源大肠埃希菌对GEN的耐药率相对较高，到达60.98%、100.00%（表1）。
表1 动物性食物源大肠埃希菌对14种抗生素的耐药率[株（%）]
2.2 动物性食物源大肠埃希菌ESBLs检测成果
222株大肠埃希菌中ESBLs检出率为12.16%（27/222）。样品ESBLs散布：鸡肉源12.5%（9/72），鸡蛋源11.3%（6/53）、猪肉源12.2%（10/82）、牛肉源10.0%（1/10）、生牛奶源20.0%（1/5）。
2.3 产与非产ESBLs大肠埃希菌耐药率的比较
除IPM外，产ESBLs菌株对其他13种抗菌药物的耐药率均显着高于非产ESBLs菌株（P<0.05）（表2）。
表2 产与非产ESBLs大肠埃希菌耐药率的比较 [株（%）]
3 评论
大肠埃希菌为革兰氏阴性短杆菌，是人和动物肠道中的正常栖居菌，分为致病性大肠埃希菌和非致病性大肠埃希菌，后者又称为一般大肠埃希菌，是人和动物肠道中兼性厌氧正常菌群的优势菌种，一般对机体无害。当在外界环境发生改变、机体免疫力下降或其他病原菌感染等条件下，可引起继发感染。跟着对其所形成的疾病研讨的增多，发现其所形成的感染性疾病居各种常见细菌性感染疾病的首位[2]，因为抗生素乱用，近年来动物和人类大肠埃希菌的耐药性逐步增高[3]，在畜牧养殖业过程中，不管抗菌药物是作为医治用仍是作为促成长剂用，在抗菌药物的挑选性压力下，肠道细菌很易发生耐药性改变[4-6]。
研讨标明动物源性大肠埃希菌的耐药率与养殖场抗菌药的运用剂量、频率存在很强的相关性[7]。本实验成果显现，动物源性食物大肠埃希菌对动物常用抗生素CIP、NOR、RIF的耐药率很高，到达81.08%～92.79%；对AMP、CFT、CTX、TET、DOTC、CHL、TRI的耐药率介于3.60%～9.01%；对AMK和IPM高度灵敏。与人类临床大肠埃希菌耐药性不尽相同[8-10]，耐药性CIP、RIF高于临床，灵敏性IPM、AMK与临床类似，其他抗生素临床别离大肠埃希菌菌株的耐药性要高于本实验成果。研讨标明动物源性食物别离的大肠埃希菌已对多种抗生素具有必定的耐药性，提示动物临床用药应根据药敏实验成果，有针对性地运用，一起要首选不简单诱导细菌发生耐药性的药物，并且有必要常常替换抗生素品种，避免发生新的耐药菌株。
ESBLs是一类能水解广谱青霉素，第三代头孢菌素及单环β-内酰胺酶类抗生素的β-内酰胺酶，使产酶菌在有β-内酰胺酶抗生素存在条件下能持续生计，但对碳青霉烯类及酶类抑制剂灵敏。别的，产ESBLs菌不仅对第三代头孢菌素和氨曲南耐药，并且对氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺类抗菌药物也可穿插耐药，所以产ESBLs细菌的医治已成为临床上一大难题，其耐药基因能够经过接合、转化、转导等方法在同种属，乃至不同种属间传递，形成耐药性在细菌间传达[11]，给临床感染的操控带来困难。虽然本实验ESBLs检测成果（12.16%）低于临床菌株（41.42%～69.2%）[8-10，12]，但阐明在动物源性食物中大肠埃希菌具有必定的ESBLs菌株，应引起注重。产ESBLs菌株对除IPM外其他13种抗生素的耐药率高于非产ESBLs菌株（P<0.05），与临床类似[8]，表现为ESBLs阳性菌较ESBLs阴性菌具有较高耐药性[13]。
实验成果显现，动物源性大肠埃希菌对许多抗生素已具有必定的耐药性。虽然现在尚无有力根据证明动物源性食物耐药大肠埃希菌菌株能够经过食物链诱发人体疾病，可是摄入人体的动物性食物源耐药大肠埃希菌菌株把人体肠道作为暂时旅居地，很可能把耐药基因搬运至人体肠道正常菌群中，这种耐药基因在细菌间传达，是多重耐药病原菌不断发生的重要原因[11，14]，肠道菌群，尤其是大肠埃希菌在温血动物肠道内密度大，被认为是食源性肠道病原菌多重耐药基因的首要储存库[15]，带着耐药基因的大肠埃希菌与共生的沙门菌、致病性大肠埃希菌及其他肠道病原菌经过可移动基因元件的搬运进行基因物质的交流[16-18]，使各种药物灵敏菌发生耐药性，乃至引起“超级细菌”的发生，有报导显现，自链霉素作为滋长剂运用于畜牧出产时，大肠埃希菌中呈现操控耐药性可搬运质粒，这种质粒曾在猪、饲养员及其家人别离的大肠埃希菌中被发现，也在人群肠道别离的大肠埃希菌中被发现[19]，但这些人群从未与养猪场触摸，仅仅住同一区域[20]，这提示耐药菌质粒能够从动物性食物以食物链的方法传入人体。
总归，作为大肠埃希菌耐药性菌株发生的首要来历之一，应加强动物源性食物大肠埃希菌的耐药性检测，为相关从业者和部分供给参阅根据，削减动物源性食物作为耐药病原菌的潜在“蓄水池”。
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（收稿日期：2014-10-09 本文修改：李亚聪）
