蒋德菊等
[摘要] 意图 检测MMP-9、TIMP-1在复发性流产绒毛安排中的mRNA相对表达量，研讨MMP-9和TIMP-1的表达失衡与复发性流产的相关性。 办法 选取2013年4～12月我院妇科门诊正常早孕和复发性流产妇女的绒毛安排各19例和28例，RT-PCR检测MMP-9、TIMP-1的相对表达量。 成果 复发性流产组绒毛MMP-9 mRNA的相对表达量为4.11±0.42，正常早孕组绒毛MMP-9 mRNA的相对表达量为2.45±0.36，两组比较差异有核算学含义（P<0.01）；复发性流产组绒毛TIMP-1 mRNA相对表达量为7.62±1.54，正常早孕组绒毛TIMP-1相对表达量为8.41±1.02，两组比较，差异无核算学含义（P>0.05）。 定论 复发性流产绒毛安排中的MMP-9 mRNA表达量显着下降，TIMP-1 mRNA表达量升高，MMP-9和TIMP-1的表达失衡参加了复发性流产的发作、开展。
[关键词] 复发性流产；MMP-9；TIMP-1
[中图分类号] R714.21 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）08（a）-0093-04
天然流产接连发作≥2次称为复发性流产，复发性流产临床较常见，近年来其发病有上升趋势，严重影响患者的身心健康，影响家庭幸福和社会健康开展，因而根究复发性流产的发病机制，为临床医治和防备复发性流产供给科学依据有重要含义。本研讨选用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测不明原因复发性流产和正常早孕绒毛安排中MMP-9及TIMP-1 mRNA相对表达量，经过比较两组MMP-9和TIMP-1的基因表达水平，评论MMP-9和TIMP-1动态失衡与复发性流产发作、开展的联系，从分子水平研讨复发性流产的发作、开展机制。
1 材料与办法
1.1 一般材料
研讨方针为2013年4～12月在我院妇科门诊就诊患者，年纪18～35岁，月经周期5～7/28～30 d，停经45～60 d，经临床妇科查看、β-HCG和孕酮、彩超证实为宫内妊娠，自愿挑选人流的宫内妊娠活胎19例和复发性流产28例（天然流产≥2次，各项查看提示胚胎停育）。流产前两组病史、年纪、孕产次、停经天数均无显着差异。
1.2标本收集
1.2.1 正常早孕组19例 彩超提示：宫内单活胚。惯例负压吸宫术选取吸出物中的绒毛安排，液氮冻存。
1.2.2 复发性流产组28例 彩超提示：宫内妊娠未见胎心，结合β-HCG和孕酮，确诊为胚胎停育，行负压吸宫术，留取绒毛安排液氮冻存。
1.3 研讨办法
1.3.1 试剂 DNA Extraction kit （BioFlux），Taq polymerase（BioCer），Realtime PCR Master Mix（BioCer），Probe GAPDH（BioRad），Probe MMP9和TIMP1（BioRD）均购于深圳市中生生物技术公司。
1.3.2 安排总RNA提取 ①取10～30 mg安排块，放入6 mm陶瓷研钵中，参加液氮，剪成1 mm见方小块，用陶瓷研磨杵充沛研磨，直至成粉；②将研磨好的粉末敏捷转入1.5 ml离心管中，离心管中预先参加 600 μl Trizol溶液，充沛倒置混匀，室温静置5 min；③搬运上清液至吸附柱中，吸附柱套上新的离心管，12 000 r/min，离心30 s；④弃去外套管中液体，向吸附柱中参加600 μl洗脱液，12 000 r/min，离心30 s；⑤重复进程④一次；⑥弃去管中液体，空柱12 000 r/min，离心1 min；⑦将吸附柱搬运到新的离心管，参加20 μl洗脱液，12 000 r/min，离心30 s。管中液体即为提取的总RNA溶液，当即用于下流试验或-80℃冻存。
1.3.3 意图基因和内参基因引物序列及产品特征 见表1、图1。
图1显现部分意图基因扩增曲线的状况，横坐标表明PCR循环数，纵坐标表明基因表达量的荧光度，基因扩增曲线与横线的交汇点表明CT值，意图基因表达浓度越高，CT值越小。A：TIMP-1基因扩增曲线；B：MMP-9基因扩增曲线
图1 意图基因扩增曲线图
1.4 核算学剖析
选用SPSS 17.0核算软件对数据进行剖析，计量材料以x±s表明，选用t查验，计数材料用百分率（%）表明，选用χ2查验，以P<0.05为差异有核算学含义。
2 成果
2.1 两组MMP-9、TIMP-1基因均匀CT值的比较
现在常用的两种剖析实时定量PCR试验数据的办法是肯定定量和相对定量。肯定定量经过规范曲线核算开始模板的拷贝数；相对定量办法是比较经过处理的样品和未经处理的样品方针转录本之间的表达差异。2-ΔΔCT办法是实时定量PCR试验中剖析基因表达相对改变的一种简洁办法，即相对定量的一种简洁办法。MMP-9均匀CT值的差值=6.87-3.51=3.36， 2-ΔΔCT=0.097，即复发性流产组绒毛MMP-9 mRNA表达量相当于正常早孕组的0.097倍；TIMP-1均匀CT值的差值=8.74-12.14=-3.398，2-ΔΔCT=10.54，即复发性流产组绒毛TIMP-1 mRNA表达量相当于正常早孕组的10.54倍（表2）。
2.2 两组mRNA相对表达量的比较
复发性流产组绒毛MMP-9 mRNA的均匀表达量为4.11±0.42，相当于正常组绒毛的0.097倍（2-ΔΔCT=0.097，表2），较正常早孕组表达显着下降，差异有核算学含义（P<0.01）；复发性流产组绒毛TIMP-1均匀表达量为7.62±1.54，相当于正常早孕组绒毛的10.542倍（2-ΔΔCT=10.54，表2），较正常早孕组表达升高，差异无核算学含义（P=0.65）（表3）。
3 评论
复发性流产在育龄妇女中的发作率约为1%[1]。复发性流产不只给孕妈妈带来心思伤口，甚至会影响到今后的妊娠结局[2]，可能导致日后不孕。约50%的复发性流产病因没有清晰[3]，滋补细胞具有高度增殖和滋润性成长的潜能[4]，但在正常胚胎植入和胎盘构成时，滋补细胞不会发作过度增殖，侵袭性成长具有严厉的时间性和空间性，限于孕前期及子宫壁的1/3处，提示机体可能经过细胞因子调控滋补细胞的成长，使其坚持动态平衡。
细胞外基质（ECM）是细胞之间的物质，是由大分子构成的扑朔迷离的网络，是阻挠细胞滋润性成长的重要屏障[5]。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是降解和再刻画细胞外基质的Zn2+依赖性中性蛋白酶宗族，对保持细胞外基质的动态平衡起重要效果。MMPs安排抑制剂（TIMPs）能够阻断体内MMPs所起的效果，胚胎滋补层和蜕膜中均有MMPs和TIMPs表达，两者间的平衡关于基质的重建和侵袭程度的操控起重要效果。MMPs低表达将会导致滋补细胞侵袭缺乏，影响胚胎的着床和正常成长发育，导致流产[6]。MMP-9是参加滋补层细胞侵入子宫内膜的首要蛋白质[7]。TIMP-1能够拮抗MMP-9，阻挠子宫内膜细胞外基质被MMP-9过度降解，阻挠滋补层细胞的过度滋润[8-10]。但各学者研讨成果不尽相同，Kuznetsova等[11]研讨发现，MMP-9水平表达低者流产的危险性添加；Iwahashi等[12]研讨提示，MMP-9经过分化Ⅳ型和Ⅴ型胶原参加流产进程；李萍[13]的研讨以为MMP-9在前兆流产蜕膜安排中表达高于正常早孕组。吕荟明等[14]研讨以为，TIMP-1 mRNA的表达量在流产组显着下降。姜广利等[15]研讨以为，正常前期妊娠的蜕膜和绒毛MMP-9和TIMP的平衡表达是保持正常前期妊娠的必要条件。
本试验成果表明，复发性流产组绒毛MMP-9 mRNA的相对表达量较正常早孕组表达显着下降，差异有核算学含义（P<0.01）；复发性流产组绒毛TIMP-1 mRNA相对表达量较正常早孕组表达升高，但差异无核算学含义。依据本试验成果估测：复发性流产组MMP-9表达量下降，TIMP-1较正常组表达升高，导致滋补细胞侵袭缺乏，胚胎着床过浅，胚胎血供养分缺乏，影响胚胎正常成长发育而致流产，MMP-9和TIMP-1的动态失衡参加了复发性流产的发作、开展，与大部分学者的研讨成果根本共同，为复发性流产的妇女药物阻断MMP-9和TIMP-1的失衡，进步妊娠成功率供给了理论依据和新思路。但是两者对生殖进程各环节的精密调理机制有待进一步研讨。
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[14] 吕荟明，孙状壮，李力男，等.MMP-2及TIMP-1、TIMP-2在天然流产绒毛和蜕膜安排中表达及含义[J].中华疾病操控杂志，2010，（7）：650-652.
[15] 姜广利，陈娟，刘宇.前期天然流产患者绒毛中MMP-9mRNA和TIMP-3 mRNA的表达[J].新医学，2010，1（41）：38-40.
（收稿日期：2015-04-03 本文修改：王红双）
