黄松++陈敬有++高皓
[摘要]意图 评论骨碎补总黄酮对骨质疏松症大鼠BMP-2蛋白表达及血清骨钙素水平的影响。办法 经过去除大鼠卵巢的办法仿制骨质疏松症模型，并将大鼠分红正常组、假手术组、模型组、骨碎补总黄酮组和钙尔奇D片组。手术后第7天开端给药，1次/d，接连12周，HE染色调查大鼠骨安排形状学改动，ELISA检测各组大鼠股骨中BMP-2蛋白表达情况以及血清中的骨钙素水平。成果HE染色成果显现，骨碎补总黄酮组大鼠股骨安排的骨小梁数量、密度、布局及完好性均优于模型组，且大鼠股骨安排中BMP-2蛋白表达量[（13.469±0.215）pg/ml]和血清中骨钙素水平[（1.61±0.09）μg/L]均别离高于模型组的（5.516±0.119）pg/ml和（0.76±0.22）μg/L（P<0.05），接近于假手术组的（15.279±0.211）pg/ml和（1.34±0.17）μg/L（P>0.05）。定论 骨碎补总黄酮医治骨质疏松症大鼠的效果显着，其效果机制可能是经过上调股骨安排中BMP-2蛋白和血清中的骨钙素水平，进而促进骨安排的构成。
[关键词]骨质疏松症；骨碎补总黄酮；骨形状发作蛋白-2；骨钙素
[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）02（a）-0012-04
[Abstract]Objective To explore the effect of Total Flavonoids of RhizomaDrynariae on BMP-2 protein expression and serum bone gla protein level in rats with osteoporosis.Methods Osteoporosis model was established by removing rat ovary，and the rats were divided into normal group，sham operation group，model group，total Flavonoids of Rhizoma Drynariae group and Caltrate D Tablet group.In the seventh days after surgery，drugs were used once per day for 12 consecutive weeks.Morphological change of bone tissue in rats was observed by HE staining，and the expression of BMP-2 protein and the level of serum bone gla protein level in the femur of rats in each group was detected by ELISA.Results HE staining indicated that the number，density，distribution，and integrity of bone trabecula in the rats femoral bone tissue in the Total Flavonoids of Rhizoma Drynariae group were superior to those in the model group.The protein expression of BMP-2 in rats femoral bone tissue and the level of serum bone gla protein [（13.469±0.215 ） pg/ml and （1.61±0.09） μg/L respectively] was much higher than that in the model group [（5.516±0.119） pg/ml and （0.76±0.22） μg/L respectively] （P<0.05）.The protein expression and serum bone gla protein level was close to that in the sham operation group respectively[（15.279±0.211） pg/ml and （1.34±0.17） μg/L] （P>0.05）.Conclusion In the treatment of rats with osteoporosis，Total Flavonoids of Rhizoma Drynaria can obtain a great effect.The possible mechanism is through up-regulation of BMP-2 protein in the femoral bone tissue and the level of serum bone gla protein，thus promoting the formation of bone tissue.
[Key words]Osteoporosis；Total Flavonoids of Rhizoma Drynaria；Bone morphogenetic protein-2；Bone gla protein
骨質疏松症（osteoporosis，OP）是一种比较常见的疾病，首要是以骨量削减、骨安排微结构退化为特征，导致骨脆性添加，骨折率高发[1]。骨形状发作蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是一种与骨安排成长相关的多功用糖蛋白，是最首要的骨构成调控因子，可以诱导未分解的间充质细胞分解为成骨细胞和软骨细胞，进而诱导新骨的构成[2-3]，BMP-2是诱导成骨活性最强的骨形状发作蛋白之一，可以直接反映新骨构成情况。骨钙素（bone gla protein，BGP）是由成骨细胞排泄的一种激素样多肽，比较稳定，不受骨吸收要素的影响，可以反映新构成的成骨细胞的活动情况，是临床上反映骨代谢情况的特异性生化目标[4]。成骨细胞分解晚期特异性表达的BGP能调控骨矿藏的堆积和搬运，促进成骨细胞老练及骨细胞的构成[5-6]。现在医治OP的临床药物极多[7]，其间以中药材药物最为杰出[8]，中药具有用果好、副效果小、经济实惠等特色，因此遭到了人们的重视。骨碎补总黄酮是中药材骨碎补根茎的提取物，研讨发现骨碎补总黄酮对OP导致的骨密度下降有显着的按捺效果[9]，并且还可以在按捺破骨细胞活性的一起促进成骨细胞增殖[10-11]，因此，骨碎补总黄酮是一种常见的医治晚年性OP的中药材，但有关骨碎补总黄酮医治晚年性OP的机制研讨还不全面。本研讨运用OP动物模型，评论骨碎补总黄酮对OP模型大鼠血清BGP和BMP-2蛋白的影响，进一步为骨碎补总黄酮有用医治OP供给新的机制观点。
1材料与办法
1.1试验动物
雌性健康的Wistar大鼠50只，鼠龄5～6个月，体重（243±21）g，未曾交配，购自于湖北省试验动物中心。
1.2试验试剂与仪器
骨碎补总黄酮（商品名：强骨胶囊，出产批号：150412，北京岐黄制药有限公司），钙尔奇D片（出产批号：150710，惠氏制药有限公司），大鼠BGP（OT）ELISA检测试剂盒（上海研谨生物科技有限公司），BMP-2试剂盒（AMEKO），多功用酶标仪（类型：Infinite M200，Tecan），低温高速离心机（类型：ST40R，Thermo），解剖手术器械（上海医疗器械手术器械有限公司）。
1.3动物分组及造模
试验前将动物随机分为两组，正常组（10只）和手术组（40只）。将手术组动物别离沿左右软肋下剪开皮肤，别离皮肤筋膜及腹膜脏层，露出腹腔，预留假手术组10只，其他大鼠进行结扎及剪除整个卵巢安排，分层缝合后，外层皮肤消毒，正常养殖，手术过程中无大鼠逝世。术后7 d再将手术组存活的大鼠随机分红4组（每组小鼠数量共同，各8只），即假手术组、模型组、骨碎补总黄酮组和钙尔奇D片组。
1.4给药及选材
手术后第7天开端给药，每天上午灌胃1次，接连12周。依据人与大鼠体表面积核算大鼠的骨碎补黄酮和钙尔奇D片用药运用量，正常组、假手术组和模型组以等量的生理盐水灌胃。灌胃期间，每周一对大鼠体表面积进行从头预算，以调整给药剂量。灌胃第12周后，禁食24 h后，眼球取血，-20℃保存。取血后，用10%水合氯醛按0.3 ml/100 g體重肌内打针麻醉后，在无菌条件下，取右后肢股主干骺端，剥离附着的肌肉及崩溃安排，充沛露出股骨头，用消毒后的老虎钳将股骨头钳碎，放入无菌的EP管中，做好符号，一部分用于白腊包埋，一部分用于提取骨安排中的蛋白。
1.5 HE染色
取小鼠股骨安排剪碎成3～5 mm后，经10%甲醛固定，10%硝酸溶液脱钙后，自来水水洗过夜，白腊包埋，切片厚度为4 μm，至于65℃恒温烘箱烤片6 h左右。将安排切片惯例脱蜡至水，水洗1～2 min，苏木精染液染色3～6 min，流水洗去苏木精染液1～2 min，然后放入1%盐酸乙醇1～3 s，稍水洗1～2 s，促蓝液返蓝5～10 s，水洗15～30 s，0.5%伊红染液染色2～3 min，蒸馏水洗1～2 s，80%乙醇15～30 s，95%乙醇15～30 s，无水乙醇1～2 s，别离在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中通明2次，每次2～3 s，中性树胶封片。在光学显微镜下（×100），调查各组小鼠股骨安排片HE染色情况。
1.6大鼠股骨中BMP-2蛋白和血清中BGP的丈量
依照ELISA检测试剂盒的阐明书要求进行，用酶标仪在450 nm波长依序丈量各孔的吸光度值（D），制作规范曲线，核算大鼠股骨安排中BMP-2蛋白的实践浓度以及各组血清中BGP水平。
1.7统计学处理
选用SPSS 17.0统计学软件剖析数据，计量材料以x±s表明，多组间比较选用方差剖析，以P<0.05为差异有统计学含义。
2成果
2.1大鼠股骨安排HE染色
如图1A、B所示，正常组和假手术组大鼠股骨安排形状结构完好，骨细胞坐落骨髓腔中心，骨髓腔较小，骨小梁粗细共同，彼此衔接成网络结构，无开裂现象，骨小梁之间空隙较小。模型组大鼠跟着卵巢安排被去除，雌激素排泄削减，骨安排形状结构不完好，骨小梁丢掉、开裂严峻，骨小梁之间衔接点较少，散布稀少杂乱，游离结尾增多，距离增大，骨髓腔交融严峻，呈现典型的骨质疏松病理形状改动，如图1C所示。骨碎补总黄酮组大鼠股骨安排与模型组相比较，骨小梁增厚，开裂削减，衔接点增多，尚可衔接成网络结构，骨小梁数量较多，密度增大，摆放规矩，完好性显着优于模型组，但比正常组和假手术组稍差，如图1D所示。钙尔奇D片组与骨碎补总黄酮组比较，骨小梁开裂较多，结构不完好，衔接点较少，具有较多的游离结尾；可是与模型组比较，钙尔奇D片组骨小梁数量、密度、衔接情况以及完好性均优于模型组，如图1E所示。
2.2 ELISA检测大鼠骨中BMP-2蛋白表达情况
各组大鼠股骨中BMP-2蛋白表达情况如表1所示，钙尔奇D片组和模型组与正常组比较，BMP-2蛋白浓度显着下降（P<0.05）。与模型组比较，骨碎补总黄酮组和钙尔奇D片组差异有统计学含义（P<0.05），提示这两组药物均能显着进步大鼠股骨中的BMP-2蛋白表达，与正常组比较，钙尔奇D片组差异有统计学含义（P<0.05），而骨碎补总黄酮组差异无统计学含义（P>0.05），提示骨碎补总黄酮对OP的医治效果比钙尔奇D片显着。
2.3大鼠血清的BGP水平改动
模型组与正常组、假手术组比较，BGP浓度下降显着（P<0.05），提示OP中骨代谢反常，BGP水平较低；骨碎补总黄酮组和钙尔奇D片组的BGP浓度高于正常组（P>0.05），骨碎补总黄酮组和钙尔奇D片组与模型组比较差异有统计学含义（P<0.05）（表2），提示骨碎补总黄酮组和钙尔奇D片组能进步OP大鼠血清中的BGP含量，然后促进骨质组成，从成果上看，骨碎补总黄酮组的效果好于钙尔奇D片组。
3评论
骨骼是人体重要的一个组成成分，它不只具有生命力还具有必定的弹性和耐性，赋予人类运动的功用，但是各种骨类疾病的发作给人类的日子质量构成很大影响。BMP是一种存在于骨基质中的酸性糖蛋白，也是一种可以诱导骨安排构成的成长因子，例如可以诱导人体间充质细胞分解为骨、韧带、软骨、肌腱和神经安排[12-13]。骨修正过程遭到多种因子的调理，而BMP-2就是其间最重要的调理因子之一。机体遭到相应外界信号影响时，BMP-2与细胞膜上的受体结合，将信息转递至细胞核内，经过转录激活相关物质促进骨安排的再生[14]。BGP是成骨细胞排泄的一种激素样多肽，是骨代谢情况的特异性生化目标，能特异性反映成骨细胞的活性[15]。BGP由成骨细胞排泄后堆积在骨安排的间质细胞外，最终开释至血液中，因此血液中的BGP与骨安排中BGP含量成正相关[16]。雌激素可以经过促进骨样细胞增殖分解和诱导骨细胞老练，到达促进骨构成的效果[17-18]，而破骨细胞和成骨细胞中也存在雌激素受体，因此常运用去除动物卵巢的办法制备OP动物模型[19-20]。本研讨选用去除大鼠卵巢的办法仿制OP模型，以及经过检测BMP-2蛋白表达以及BGP水平来评论骨碎补总黄酮组医治OP可能存在的机制。
依据大鼠股骨安排HE染色成果，可以看出模型组大鼠股骨骨安排形状结构不完好，骨小梁丢掉、开裂严峻，骨小梁之间衔接点较少，散布稀少杂乱，游离结尾增多，距离增大，骨髓腔交融严峻，是典型的骨质疏松病理形状改动，阐明造模成功。继续给药12周后，骨碎补总黄酮组大鼠骨小梁增厚，开裂削减，衔接点增多，一起骨小梁数量较多，密度增大，摆放规矩，阐明骨碎补总黄酮能显着改进OP病况。且模型组中BMP-2蛋白表达量和血清BGP水平与正常组比较显着性下降，阐明OP大鼠机体内BMP-2蛋白处于低表达水平，血清BGP处于低水平情况；但是骨碎补总黄酮组与模型组比较，大鼠体内BMP-2蛋白表达和血清BGP处于较高水平情况，阐明骨碎补总黄酮组可以进步OP大鼠机体内BMP-2蛋白表达和血清BGP水平。别的，钙尔奇D片组大鼠股骨骨安排骨小梁密度、数量及完好性稍差于骨碎补总黄酮组，优于模型组，大鼠机体内BMP-2蛋白表达和血清BGP水平也稍低于骨碎补总黄酮组，阐明骨碎补总黄酮的效果更佳，因此，骨碎补总黄酮有用医治晚年OP的机制可能是经过进步骨内BMP-2蛋白表达和血清中的BGP水平来完成的。
[参考文献]
[1]刘政，吴倩，黄帅立，等.骨质疏松症的中医病因病机与治则研讨[J].江苏中医药，2014，46（2）：42-44.
[2]Wang C，Wang J， Li J，et al.KDM5A controls bone morphogenic protein 2-induced osteogenic differentiation of bone mesenchymal stem cells during osteoporosis[J].Cell Death Dis，2016，7（8）：e2335.
[3]张春，魏琴，王雪梅，等.BMP-2体外诱导OPG-/-小鼠BMSCs向成骨方向分解的试验研讨[J].试验动物与比较医学，2012，32（3）：186-190.
[4]蔡晓燕，董光富.脂代谢及血清骨钙素水平与骨质疏松症的相关性剖析[J].我国骨质疏松杂志，2016，22（6）：711-712，730.
[5]Ducy P.The role of osteocalcin in the endocrine cross-talk between bone remodelling and energy metabolism[J].Diabetologia，2011，54（6）：1291-1297.
[6]王春玉，龙丰云，陈香，等.骨钙素介导的骨内排泄系统[J].中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志，2013，6（3）：196-202.
[7]裴育.骨质疏松症医治药物研讨新进展[J].我国医学前沿杂志（电子版），2015，7（10）：15-20.
[8]牛爱春，吴建民，郭宪章.中医药医治骨质疏松症研讨现状[J].亚太传统医药，2016，12（9）：47-49.
[9]曾年，王月义，裘邯军.骨碎补总黄酮对晚年骨质疏松症骨痛和骨密度的影响[J].山东中医杂志，2013，32（6）：387-388.
[10]谢雁鸣，秦林林，邓文龙，等.骨碎补总黄酮对成骨细胞体外培育效果的机制研讨[J].中华中医药杂志，2005，20（3）：161-162.
[11]Huang XF，Yuan SJ，Yang C.Effects of total flavonoids from Drynaria fortunei on the proliferation and osteogenic differentiation of rat dental pulp stem cells[J].Mol Med Rep，2012，6（3）：547-552.
[12]Shibasaki S，Kitano S，Karasaki M，et al.Blocking c-Met signaling enhances bone morphogenetic protein-2-induced osteoblast differentiation[J].FEBS Open Bio，2015，5：341-347.
[13]王霖霞，李玉坤.BMP-2信號通路与成骨细胞分解[J].世界骨科学杂志，2009，30（2）：132-133.
[14]Qu X，Cao Y，Chen C，et al.A poly （lactide-co-glycolide） film loaded with abundant bone morphogenetic protein-2：a substrate-promoting osteoblast attachment，proliferation，and differentiation in bone tissue engineering[J].J Biomed Mater Res A，2015，103（8）：2786-2796.
[15]Price PA，Parthemore JG，Deftos LJ.New biochemical marker for bone metabolism.Measurement by radioimmunoassay of bone GLA protein in the plasma of normal subjects and patients with bone disease[J].J Clin Invest，1980，66（5）：878-883.
[16]杨伟民，邵斌.骨代谢生化目标与骨质疏松症[J].我国骨质疏松杂志，2004，10（1）：118-121.
[17]孔德策，杨铁毅，邵进.绝经后骨质疏松骨代谢标志物研讨进展[J].世界骨科学杂志，2016，37（1）：36-41.
[18]潘启源，王直兵，张峡.雌激素经过按捺破骨细胞促进骨软骨残缺的自发修正[J].中华伤口杂志，2016，32（6）：36-39.
[19]郭军鹏，孟超，于兰英，等.补肾经验方对去卵巢所造成的大鼠骨质疏松的防治效果[J].吉林中医药，2016，36（5）：65-67.
[20]惠红岩，董玉珍.自拟补肾活血颗粒对去卵巢骨质疏松症大鼠的医治效果[J].我国病理生理杂志，2016，（9）：85-88.
（收稿日期：2016-12-25 本文修改：许俊琴）
